一种结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法及试剂盒

摘要

一种结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法及试剂盒。涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，提供一种设计简单，可简化操作、提高分析灵敏度、成本低廉的结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法及试剂盒。提取结核分枝杆菌样本的DNA；根据结核分枝杆菌embB基因序列，利用引物设计软件PrimerPremier 5设计引物和探针；构建PCR反应体系，进行PCR检测；进行熔解曲线分析及检测结果判断：通过分析熔解曲线的Tm变化确定该探针所覆盖区域是否发生突变。采用3对引物4条探针建立双管双色体系体系从而实现对位于embB基因上的6个密码子306、368、378、380、406和497的突变检测。

主权项

一种结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测试剂盒，其特征在于设有盒体、扩增试剂、对照试剂和提取试剂，所述扩增试剂、对照试剂和提取试剂放置在盒体内，所述扩增试剂包括EMB PCR MixA、EMB PCR Mix B和TB酶混合液，所述对照试剂包括EMB阳性对照和TB阴性对照，所述提取试剂为TB DNA提取液； 所述EMB PCR Mix A包括1×buffer，甘油5％，dNTP/dUTP Mix，MgCl2溶液3mM，0.4μM306‑F，2μM306‑R，0.2μM306‑P，0.4μM497‑F，2μM497‑R，0.2μM497‑P；所述1×buffer为50mM KCl，10mM Tris‑HCl，pH=8.6；所述dNTP/dUTP Mix为dATP、dCTP、dGTP各0.2mM，dUTP0.4mM； 所述EMB PCR Mix B包括1×buffer，甘油5％，MgCl2溶液3mM，dNTP/dUTP Mix，0.4μM368‑406‑F，2μM368‑406‑R，0.2μM368‑380‑P，0.2μM406‑P；所述1×buffer为50mM KCl，10mM Tris‑HCl，pH=8.6；所述dNTP/dUTP Mix为dATP、dCTP、dGTP各0.2mM，dUTP0.4mM； 所述EMB阳性对照为EMB野生型标准质粒；所述TB阴性对照为TB DNA提取液、H2O、Tris或生理盐水；所述TB DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX‑100； 306‑F、306‑R、368‑406‑F、368‑406R、497‑F、497‑R、306‑P、368‑380‑P、406‑P、497‑P的具体序列为： 306‑F：5′‑GCGCGAATACGTCGGACAA‑3′ 306‑R：5′‑CAGCAGCGACCAGCACACTA‑3′ 368‑406‑F：5′‑AGCGACGCCAGTCTGTGGAT‑3′ 368‑406R：5′‑TGGCTGTACCGCATGGACCTT‑3′ 497‑F：5′‑TTGCCGTTGGTGTCGCCGAT‑3′ 497‑R：5′‑CGGTGGGCAGGATGAGGTAGTAGT‑3′ 306‑P：5′‑FAM‑TCGGCATGGCCCGAGTCGCCG‑Dabcyl‑3′ 368‑380‑P：5′‑TET‑TTGCCGTTTGCTGGCCTCCACACCTCACGCGGCA‑BHQ1‑3′ 406‑P：5′‑FAM‑TGCGGCAGAGGGCATGATGCCG‑BHQ1‑3′ 497‑P：5′‑TET‑TGTGGGTGTTCCGCGACCAGACCCAC‑BHQ1‑3′。