咽拭子标本手足口病Cox A16病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法

摘要

本发明公开了一种咽拭子标本手足口病CoxA16病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法，其引物和探针序列如下:CA16FP：5’-CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3’；CA16RP：5’-GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’；CA16P：5’-CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3’；本发明能够方便了临床医生和口岸检疫工作者采样操作，具有成本低、检测周期短，能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据。探针实时荧光PCR检测肠道病毒COXA16方法特异性高、重复性好、灵敏度高，可以广泛应用于临床和口岸手足口病的诊断和检测。

主权项

1.一种咽拭子标本手足口病CoxA16病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括用于检测病毒的引物和探针序列，其中引物和探针序列如下:CA16FP：5’-CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3’；CA16RP：5’-GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’；CA16P：5’-CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3’。2、一种手足口病COXA16病毒real-timeRT-PCR非诊断性检测方法，其特征在于，该方法具体为：1）根据COXA16病毒基因序列，设计引物和探针序列如下:CA16FP：5’-CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3’；CA16RP：5’-GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’；CA16P：5’-CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3’；2）提取待测样品RNA;3）以待测样品RNA为模板，在包括步骤1)所述引物和探针序列的RTPCR反应体系中进行RTPCR反应;4）采用实时PCR检测仪进行PCR扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的Ct值阈值和最高荧光强度判断结果，荧光RTPCR反应呈阳性，则待测样品含有COXA16病毒核酸。3、如权利要求2所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述RTPCR反应体系为：2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μl，TaKaRaExTaqHS5U/μl0.5μl，PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μl，RNaseFreedH2O4.5μl，ROXReferenceDyeII50×0.5μl，Primer40μmol/L各0.5μl，Probe10μmol/L0.5μl，模板5μl，反应体系共计25μl。4、如权利要求2所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述RTPCR反应的反应条件为：42℃，8min；95℃，10s；95℃，5s，59℃，34s，45Cycles；退火温度按54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃分别试验优化，退火温度为59℃时，反应曲线呈典型的S型，荧光信号最强，本方法选择59℃作为退火温度进行所述RTPCR反应。