基因重组人胸腺素β4的制备方法

摘要

一种基因重组人胸腺素β4的制备方法，包括基因的获得、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白和毕赤酵母电转化人胸腺素β4的连接、多拷贝插入重组子的筛选、基因重组人胸腺素β4融合蛋白毕赤酵母发酵、基因重组人胸腺素β4的纯化步骤。本发明利用人I型人胶原蛋白在毕赤酵母的高表达特性引导人胸腺素β4在毕赤酵母中稳定高效表达。在融合蛋白的I型人胶原蛋白前导肽与人胸腺素β4之间引入肠激酶切位点，避免了人胸腺素β4因为分子量较小，表达、纯化过程中所遇到的难题，增加了表达量，简化了纯化程序，提高了产品的提取纯化效率，可用于制备基因重组人胸腺素β4。

主权项

一种基因重组人胸腺素β4的制备方法，其特征在于它包括下述步骤：（1）基因的获得从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计Ⅰ型人胶原蛋白基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ，Ⅰ型人胶原蛋白基因PCR扩增引物的序列为：F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法扩增获得Ⅰ型人胶原蛋白基因，Ⅰ型人胶原蛋白基因的核苷酸序列为:1       CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT61      GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC121     AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT181     CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT241     GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG301     CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA361     GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT421     GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA481     CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC541     GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA601     GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT661     CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT721     CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT781     GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC841     CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT901     GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT961     GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT1021    GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT1081    GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT1141    GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT1201    CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA1261    CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT1321    GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG1381    CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC1441    CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT1501    GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT1561    CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT1621    GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT1681    GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT1741    GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT1801    GAGACAGAAT TC设计并全基因合成人胸腺素β4的核苷酸序列，氨基酸序列不变，同时添加限制性内切酶酶 切位点EcoR Ⅰ、Not Ⅰ、肠激酶切割位点GATGACGATGACAAG，人胸腺素β4的核苷酸序列如下：1       GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT61      AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC121     ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C（2）载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白、人胸腺素β4的连接对pPIC9K、Ⅰ型人胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K‑COL1；对pPIC9K‑COL1质粒与人胸腺素β4分别进行EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K‑COL1‑Tβ4；该重组DNA序列如下：1       CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT61      GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC121     AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT181     CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT241     GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG301     CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA361     GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT421     GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA481     CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC541     GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA601     GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT661     CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT721     CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT781     GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC841     CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT901     GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT961     GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT1021    GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT1081    GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT1141    GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT1201    CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA1261    CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT1321    GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG1381    CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC1441    CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT1501    GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT1561    CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT1621    GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT1681    GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT1741    GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT1801    GAGACAGAAT TCGATGACGA TGACAAGTCT GACAAACCCG ATATGGCTGA GATTGAGAAG1861    TTCGATAAGT CTAAGTTGAA GAAGACTGAG ACTCAAGAGA AGAATCCATT GCCTTCCAAG1921    GAGACCATTG AGCAGGAGAA GCAGGCCGGT GAATCTTAAG CGGCCGC（3）毕赤酵母电转化将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K‑COL1‑Tβ4质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇水溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；（4）多拷贝插入重组子的筛选将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子；（5）基因重组人胸腺素β4融合蛋白毕赤酵母发酵将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，FBS培养基的配制方法为：1LFBS含甘油40g、K2SO418.2g、H3PO426.7ml、CaSO4.2H2O0.93g、MgSO414.9g、KOH4.13g；30℃、pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃、诱导温度29℃、pH值为4.5、溶氧控制在20%～30%，流加入质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵36～42小时；（6）基因重组人胸腺素β4的纯化发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为0.1μm的中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得融合蛋白；用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，用分子量为10000D或30000D或40000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白；对人胸腺素β4粗蛋白用装有DEAE Sepharose FF填料的层析柱进行层析分离，得基因重组人胸腺素β4，人胸腺素β4氨基酸序列如下：1   SDKPDMAEIE KFDKSKLKKT ETQEKNPLPS KETIEQEKQA GES。