一种利用LDR技术检测荷斯坦牛乳脂率分子标记的方法

摘要

本发明公开了一种利用LDR技术检测荷斯坦牛乳脂率分子标记的方法，其特征在于，步骤如下：（1）扩增用于LDR反应包含A8398G位点的片段：以荷斯坦牛A8398G基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNTPs存在的情况下，用引物在PCR条件下进行扩增，用于LDR反应；（2）进行LDR反应：设计三条探针，然后进行LDR反应；（3）分析：LDR反应产物由ABI PRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度与各基因型进行关联分析。本发明的利用LDR技术检测荷斯坦牛乳脂率分子标记的方法，以碱基错配为基础，使用特异性探针对特定片段DNA进行识别，具有很高的准确性与其他SNP检测技术相比，LDR检测技术拥有准确度高、通用性强、通量大、操作简单、成本低等优点。

主权项

一种利用LDR技术检测中国荷斯坦牛乳脂率分子标记的方法，其特征在于，步骤如下：（1）扩增用于LDR反应包含PRL基因A8398G位点的片段：以中国荷斯坦牛基因组DNA为模板，用引物在PCR条件下进行扩增，PCR产物大小为156bp，用于LDR反应；所述引物的序列如下：上游引物：GAGCTTGATTCTTGGGTTGC；下游引物：ATCATCTCCATGCCTTCCAG；所述PCR扩增的条件和参数为：PCR反应采用20μl体系：包括2.0μl PCR缓冲液；0.6μl Mg2+；2.0μl dNTP；0.2μl Taq酶；4.0μl Q‑solution；2.0μl引物；1.0μl基因组DNA；最后加入8.2μl去离子水；PCR程序为：95℃变性15分钟；94℃30秒，59℃1分钟，72℃1分钟，35个循环；最后72℃延伸7分钟；（2）进行LDR反应：设计三条探针，然后进行LDR反应；所述三条探针的序列分别如下：A8398G_MODIFY：P‑ACCTCGGTGACTAGGTGATACAGAGTTTTTTTTTTTTTTTT‑FAM；A8398G_A：TTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGT；A8398G_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGC；其中，A8398G_MODIFY的末端带有FAM修饰，5’端磷酸化；探针A8398G_A的3’末端碱基与A对应，探针A8398G_G的3’末端碱基与G对应；所述LDR反应的具体步骤为：在200μl的PCR反应管中，分别加入1μl缓冲液；1μl上述三条探针的等比混合物；0.05μl连接酶；6.95μl去离子水，最后加入1μl前述PCR产物；连接反应程序为：95℃变性2分钟；94℃30秒，60℃2分钟，35个循环；（3）分析：LDR反应产物由ABI PRISM‑377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度与各基因型进行关联分析，结果如下：基因型AA的LDR产物片段长度为82bp，基因型GG的LDR产物片段长度为84bp，基因型AG的LDR产物片段长度为82bp和84bp的混合。