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一种密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，其包括如下步骤：BMSCs的分离，BMSCs的原代培养，BMSCs的传代培养与扩增，培养细胞表面抗原检测以及生长曲线的测定；其中，所述BMSCs的分离步骤包括：骨髓收集并在无菌条件下进行肝素抗凝收集的骨髓悬液，D‑Hanks液稀释，在离心管加入Ficoll分离液，稀释后的骨髓悬液缓慢加在Ficoll分离液上，1800转/分钟离心15分钟，收集富含有核细胞的界面层细胞，D‑Hanks液清洗，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于的培养瓶，在37℃、5％CO2、饱和湿度静置培养；所述BMSCs的原代培养步骤包括：培养72小时后全量换液，之后每2天换一次液；细胞生长达到70％融合后，吸出培养基，D‑Hanks液洗一遍培养瓶；然后用0.25％的胰蛋白酶消化3‑5分钟，待细胞回缩折光性增强以致有细胞浮起时加入含血清培养基终止，移液管反复吹打培养瓶底，吸出悬液后离心收集细胞；悬浮细胞在换液时被去除；所述BMSCs的传代培养与扩增步骤包括：调整细胞浓度，以1∶3的比例传代培养，之后每2天换液一次，直至再次传代；所述培养细胞表面抗原检测步骤包括：取培养第2或第3代细胞，首先用0.25％的胰蛋白酶消化后，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至1×107/ml，然后加入鼠抗人单克隆抗体，置4℃孵育半小时，PBS清洗后进行流式细胞仪检测分析；以及所述生长曲线的测定步骤包括：分别取生长状态良好的原代、第3代、第15代培养细胞制备成单细胞悬液，按1×104/ml接种于24孔板，每孔加入1ml培养基，以后每天随机取3个孔，消化后计数，计算平均值，持续计数8天，绘制出各代培养细胞的生长曲线。 |
