人胚中脑神经干细胞的原代细胞的分离传代培养方法

摘要

本发明提出一种人胚中脑神经干细胞的原代细胞的分离传代培养方法，其应用于人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化过程，所述体外分离培养及分化过程是从人胚中脑中分离培养并鉴定神经干细胞。其包括步骤原代中脑神经干细胞的分离培养、原代细胞的传代培养、细胞诱导分化、免疫细胞化学染色以及细胞计数。本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术从从人胚中脑中成功建立一株人胚神经干细胞，并进行培养、传代，贴壁分化观察，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原，分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。

主权项

一种人胚中脑神经干细胞的原代细胞的分离传代培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：原代中脑神经干细胞的分离培养，原代细胞的传代培养，细胞诱导分化，免疫细胞化学染色以及细胞计数；其中，所述原代中脑神经干细胞的分离培养的步骤具体为：取胚龄10～13周水囊引产的新鲜人胚胎，在显微镜下无菌分离出胚胎中脑组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含B27、EGF、bFGF的DMEM/F12无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整活细胞浓度为1×105/ml，将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶，在37℃，5％CO2条件下静置培养；所述原代细胞的传代培养的步骤具体为：原代克隆形成后用0.25％胰酶37℃消化15～30分钟或采用机械切割分离或吹打方式制成单细胞悬液，用含B27、EGF、bFGF的无血清培养基将细胞悬液按1×106/ml浓度传代接种于培养瓶，在37℃，5％CO2条件下静置培养，直至次代克隆球的产生；平均5～7天传代一次；所述细胞诱导分化的步骤具体为：将不同代数的神经球体外培养7天后种植入多聚赖氨酸包被的含胎牛血清培养基培养皿中，体外3小时，10天，14天各进行一次免疫细胞化学染色；所述免疫细胞化学染色的步骤包括：以间接免疫荧光法检测刚贴壁3小时神经球中神经巢蛋白表达，及检测神经球体外分化14天后，分化细胞中神经微丝、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷的表达；以及用SABC组织化学染色试剂盒检测在神经球分化10天后，分化细胞中酪氨酸羟化酶的表达；所述细胞计数的步骤具体为：将化学染色后的细胞样本倒置显微镜下对分化的细胞随机选择4个独立视野计数免疫细胞及总细胞数。