利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小RNA的方法

摘要

一种寡核苷酸体外扩增方法，该方法利用了聚合酶-内切酶链式反应(polymerase-endonuclease chain reaction，简称PECR)。该方法包括利用含有重复序列的单链DNA探针，通过耐热DNA聚合酶延伸目标寡核苷酸，耐热限制性内切酶或单链切口酶切割延伸产物，通过热循环反应扩增特定的目标寡核苷酸。PECR只需要一个探针而不是一对引物，就能够实现以指数扩增特定的寡核苷酸。PECR反应过程由热循环精密控制，循环参数可根据目标寡核苷酸的长度、序列、解链温度和初始分子数灵活调节，扩增速率完全取决于反应体系中目标核酸的初始分子数。可对生物样品中微量的特定小分子核酸如寡核苷酸和microRNA进行扩增和定量分析。PECR操作简便、高效且稳定，不需使用通用引物，扩增特异性更高，可广泛应用于分子生物学研究。

主权项

一种利用聚合酶‑内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小RNA的方法，该方法包括：（1）反应混合物的构成：①包含目标序列X的目标核酸，目标核酸为单链或双链核酸，目标序列X长度为8～50碱基或碱基对，其解链温度即Tm值的范围为36～79℃；②探针X’R’X’，其中X’为与目标序列X互补的序列，探针X’R’X’是单链DNA，含有两个串联重复的X’，在这两个重复序列之间有一个限制性内切酶的识别位点的互补序列R’；③耐热DNA聚合酶；④耐热限制性内切酶；⑤四种三磷酸脱氧核糖核苷酸：dATP,dGTP,dCTP和dTTP；⑥适当的缓冲液；（2）热循环反应：将所述反应混合物在60℃至99℃预变性0～600秒后，再进行1至100个热循环处理，热循环包括如下4个步骤：①变性(Denaturing)：保温于高于目标核酸分子的解链温度即Tm值5℃以上的温度，温度范围为60～99℃，持续时间1～60秒；②退火(Annealing)：保温于目标核酸分子的解链温度即Tm值上下5℃以内的温度，温度范围为35～68℃，持续时间1～60秒；③延伸(Elongation)：保温于高于目标核酸分子的解链温度即Tm值5℃以上的温度，且为所述DNA聚合酶的最适工作温度，范围为45～89℃，持续时间1～60秒；④切割(Cleaving)：保温于高于目标核酸分子的解链温度即Tm值5℃以上的温度，且为所述限制性内切酶的最适工作温度，范围为45～89℃，持续时间1～300秒；所述步骤①、③、④的温度均高于步骤②的退火温度，至少相差10℃；按照①至④进行变性、退火、延伸和切割，使目标分子成倍扩增，扩增产物是双链分子XRX/X’R’X’，双链目标分子X/X’或单链目标分子X；其中，所述耐热DNA聚合酶没有链置换活性，所述耐热限制性内切酶是双链内切酶。