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一种酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的方法，采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，通过加入EGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞，所述方法包括如下步骤：hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测；其中，所述hAMSCs的分离步骤包括：无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D‑Hanks液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约1mm3碎块，加入胰蛋白酶37℃消化10分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入II型胶原酶消化液，37℃消化30分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；1000转/分钟离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为1×106/ml，接种至培养瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培养基；置37℃、饱和湿度、体积分数5％的CO2培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液1次，并摄片记录；待细胞汇合度达80％后，用0.25％胰蛋白酶‑0.02％EDTA溶液于37℃消化2‑3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以1×107/ml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液1次，待细胞长满70％瓶底重复以上步骤；所述hAMSCs的原代培养步骤包括：将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000rpm离心15分钟，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500转/分钟进行15分钟洗涤，收集细胞；接种细胞前吸取FBS加入细胞培养瓶，置37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×106细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4‑5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以 后每3‑4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80‑90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶‑0.01％EDTA消化，得到原代细胞；所述hAMSCs的传代培养与扩增步骤包括：观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80‑90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入0.25％胰蛋白酶‑0.01％EDTA消化液浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，摇动吹打后见细胞呈圆形漂起时加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1∶2‑1∶3比例传代培养；培养体系为20％FBS，4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液15ml/瓶；置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第1代hAMSCs，待细胞生长至80‑90％汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增；所述hAMSCs细胞免疫表型的检测步骤包括：取培养第2或第3代细胞，首先用胰蛋白酶消化后，然后用含小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至1×107/ml；分别加入鼠抗人单克隆抗体，置4℃孵育半小时，PBS洗1次，进行流式细胞仪检测分析。 |
