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一种牛混合羊精液体外受精新方法，其特征在于：按如下的步骤进行：（一）、配制试剂：（1)配制牛卵母细胞捡卵液：H‑M199+10%FBS4℃保存，使用期限为一个月;（2）配置牛卵母细胞成熟液:M199+1µg/mlE2+0.1IU/mlFSH+1IU/mlLH+10%FBS4℃保存，使用期限为一个月; （3）配制牛体外受精液BO液：使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（4）配制BO‑A受精液：使用BO液进行溶解，现配现用;（5）配制BO‑B受精液：使用BO液进行溶解，现配现用;（6）配制BO‑AB受精液：等量BO‑A与BO‑B混合,现配现用;（7）配制牛体外受精培养液Stock A液：名称浓度Nacl 997.6mMKcl 71.63mMKH2PO411.90mMMgcl2·6H204.919mMNa‑lactate0.616 (V/V)%Glucose14.99mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（8）配制牛体外受精培养液Stock B液：名称浓度NaHCO3250.0mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（9）配制牛体外受精培养液Stock C液：名称浓度Na Pyrucate32.72mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（10）配制牛体外受精培养液Stock D液：名称浓度Cacl2·2H2O171.4mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（11）配制牛体外受精培养液Stock X液：名称浓度L‑Glutamine99.90mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（12）配制牛体外受精培养液Stock Y液：名称浓度Sodium citrate34.00mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（13）配制牛体外受精培养液Stock Z液：名称浓度myo‑Inositol277.0mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（14）配制牛体外受精培养液IVC SOF液： SOF液体总体积10mlstockA1mlstockB1mlstockC100µlstockD100µlstockX100µlstockY100µlstockZ100µlNEAA100µlEAA200µlBSA0.08gP/S10µl酚红10µl超纯水7.18ml4℃保存，使用期限为一个月;（二）、体外受精：（1）牛卵细胞的成熟培养：①屠宰3h之内的新鲜牛卵巢用无菌生理盐水冲洗3次并浸泡在干净的生理盐水中,用20ml注射器17#针头抽取直径在2‑8mm的卵泡，将采集后的卵泡液放在10cm培养皿中，在显微镜下捡出卵丘‑卵母细胞复合体COCs；②把牛卵母细胞捡卵液与牛卵母细胞成熟液放在38.5℃，5%的二氧化碳培养箱中平衡1h以上，然后将拣出的卵丘‑卵母细胞复合体COCs用平衡好的牛卵母细胞捡卵液洗一遍，再用牛卵母细胞成熟液洗两遍后，取一四孔板，每孔先加入500µl牛卵母细胞成熟液，再加入500µl石蜡油，按照每孔50‑120枚的数目放入牛卵母细胞成熟液中，在38.5℃，5%二氧化碳培养箱内进行成熟培养22h；（２）体外受精：①取50ml烧杯两个，分别标记为A和B：A配制牛体外受精液BO‑A液，B配制牛体外受精液BO‑B液；配置好的牛体外受精液BO‑A液和BO‑B液分别用0.2μm滤器过滤到新的50ml烧杯中，均放入37.5℃恒温水浴锅中预热；②取牛、羊原精混合，加入5ml预热的牛体外受精液BO‑A液，轻轻将混合精液混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入5ml预热的牛体外受精液 BO‑A液，轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min，弃掉上清后，用预热的牛体外受精液BO‑AB液将牛羊混合精子浓度稀释为1000万/ml；③用②处理好的精液在35mm皿中做100µl的精子滴，做好后加入石蜡油放入38.5℃，5%二氧化碳培养箱中；④打开显微镜保温板升至37.5℃，在显微镜下拣出成熟22h的牛卵细胞，在预热的牛体外受精液BO‑AB液中洗3次，将③中做好的精子滴从培养箱中拿出，每个精子滴加入10枚卵，38.5℃，5%二氧化碳培养箱中培养6h；（３）受精卵的体外发育培养：受精6h后，用培养箱中预热的牛体外受精培养液IVC SOF液脱掉颗粒细胞，然后，把脱掉颗粒细胞的卵子放入预热的每孔含500µl牛体外受精培养液IVC SOF液，上盖500µl石蜡油的四孔板中，38.5℃，5%二氧化碳培养箱继续培养。 |
