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一种表达耐高温木聚糖酶的工程菌，其是将质粒图谱如附图2所示的表达载体pKLAC1‑mxynB(64)通过电转化导入乳酸克鲁维酵母GG799中得到的，包括以下步骤：（1）挑取新鲜的单菌落于5ml组成为酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％的YPD液体培养基中，于30℃，250rpm过夜培养；（2）在室温下以体积比0.1％的接种量接种于100ml新鲜配制的YPD液体培养基中，于30℃，250rpm培养至OD600为0.4～0.5；（3）在4℃下3000rpm离心5分钟，收集细胞；（4）用250ml冰预冷的无菌水洗涤细胞一次；（5）用50ml冰预冷的无菌电转化缓冲液EB洗涤细胞一次；1L缓冲液EB中含蔗糖92.4g，氯化镁2.03g，10mmol/L pH7.5的MES缓冲液1L；（6）将细胞重悬于50ml冰预冷的无菌预处理缓冲液，于30℃静止，培养30分钟；（7）在4℃下3000rpm离心5分钟，收集细胞；（8）用10ml冰预冷的无菌电转化缓冲液EB洗涤细胞一次；（9）用200μl冰预冷的电转化缓冲液EB重悬细胞，以每管50μl分装于小管；（10）向每管中加入2μl线性化的表达质粒pKLAC1‑mxynB(64)，混匀，冰上放置15分钟；（11）将混合了DNA的感受态细胞转入0.2cm的电转杯；（12）在Gene‑Pulser电转仪上，在1000V，400Ω，25μF条件下电击细胞；（13）马上加入1ml冰预冷的YPD液体培养基于经转化的细胞中，混匀后转入1.5ml离心管；（14）用1ml无菌水洗涤细胞2次；（15）将细胞用无菌水稀释1000倍，涂布含5mM乙酰胺的酵母基本碳源培养基YCB，30℃培养3~5天挑选较大的菌落作为阳性转化子；所述含5mM乙酰胺的酵母基本碳源培养基YCB其1L配方为：1mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液30ml,YCB培养基粉末11.7g,琼脂20g,乙酰胺0.3g；所述表达载体pKLAC1‑mxynB(64)是通过以下步骤得到的：1）采用PX1、PX2引物，提取海栖热袍菌（Thermotoga maritima），MSB8的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增耐高温木聚糖酶基因mxynB(64)；所述PX 1引物为：5’–CCCctcgagAAAAGAATGAAA ATATTACCTTC‑3’；所述PX2引物为5’–TTTggtaccTCATTTTCTT TCTTCTATCTTTTTCT‑3’，小写部分分别为XhoI和KpnI酶切位点；2）回收PCR产物，将其连接到载体pMD18‑T‑Simple上；3）用限制性内切酶XhoI和KpnI分别对pMD18‑T‑xynB(64)和pKLAC1进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其连接，得到表达质粒pKLAC1‑mxynB(64)。 |
