一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法

摘要

本发明涉及一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。采用的技术方案是：1)酿酒酵母细胞的活化；2)抗朊病毒药物的初筛选：将待测药物、YPD液体培养基以及调试好的酿酒酵母细胞菌悬液，振荡培养1～5天，通过菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；3)使用SDD-AGE/Western blot的方法，定量检测抗朊病毒药物的作用效果；4)用全自动图像分析系统Dolphin-DOC进行图像扫描，分析。本发明可精确地在蛋白质水平通过检测细胞内朊病毒蛋白聚集体的可溶性变化来评估药物的作用效果；通过定量检测朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化，完成在蛋白质的水平上判断药物对朊病毒的作用大小。

主权项

一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法，其特征在于步骤如下：1）酿酒酵母细胞的活化：取酿酒酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae）接入YPD液体培养基中，30℃水浴振荡培养18 h，然后用YPD进行酵母菌初始OD值的调试，调制菌悬液OD600=0.5；所述的酿酒酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae）是ATCC 208719；2）抗朊病毒药物的初筛选：取无菌冻存管，加入待测药物、YPD液体培养基以及调试好的酿酒酵母细胞菌悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的酿酒酵母细胞放入新的装有YPD液体培养基和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1~5天，每天取菌悬液少量稀释涂平板到1/2YPD固体培养基上，通过观察菌落颜色的变化初步判断待测药物的作用效果；3）定量检测抗朊病毒药物的作用效果：酿酒酵母细胞裂解液的制备：取2）步中，经药物作用不同时间后稀释涂平板在1/2 YPD上长出的单菌落，按菌落颜色分组，每组挑取3‑5个单菌落接种到10 ml YPD液体培养基中30℃摇床活化18 h，然后再以1%的接种量接种到50 ml YPD液体培养基中扩大培养12h，离心收集细胞，然后加入裂解缓冲液，用珠磨仪裂解细胞，离心收集上清得到蛋白样品；所述的裂解缓冲液组成为：25 mM Tris‑Cl，pH 7.4，100 mM NaCl，50 mM KCl，5 mM MgCl2，4% 甘油，1%TritonX‑100，2.5 mM EDTA，0.1%SDS， 2 mM DTT现用现加，5 mM PMSF现用现加；琼脂糖凝胶电泳：用含0.1% SDS的TBE配制1.5%琼脂糖凝胶，用含0.5%SDS的上样缓冲液于42℃温育蛋白样品10 min，然后将蛋白样品在100 V，4℃的条件下电泳至凝胶前沿，再将蛋白湿法电转移到PVDF膜上，进行免疫印迹反应，并曝光X光片获得图像信息；4）用全自动图像分析系统Dolphin‑DOC进行图像扫描，分析。