| 主权项 |
一种六胜肽的合成方法，由下述步骤组成：（1）树脂溶胀将Rink‑Amide‑AM‑Resin 树脂加入烧瓶中，每克Rink‑Amide‑AM‑Resin 树脂加入10mL二氯甲烷，室温搅拌浸泡30分钟使其充分溶胀；（2）制备氨基树脂在步骤（1）溶胀的树脂中通入氨气，密封，室温搅拌浸泡30～60分钟，300目砂芯过滤除去溶剂，用二甲基甲酰胺清洗树脂，得氨基树脂；（3）合成保护肽树脂在步骤（2）的氨基树脂中加入N,N‑二甲基甲酰胺，室温搅拌，加入Fmoc‑Arg(pbf)‑OH、O‑苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲四氟硼酸、苯并三氮唑、二异丙基乙胺，氨基树脂与Fmoc‑Arg(pbf)‑OH、O‑苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲四氟硼酸、苯并三氮唑、二异丙基乙胺的摩尔比为1：3：3：3：6，室温搅拌反应3～5小时，用N,N‑二甲基甲酰胺清洗树脂，得保护肽树脂，序列为Fmoc‑Arg(pbf)‑ HN‑ resin；（4）合成H2N‑Arg(pbf)‑HN‑ resin在每克保护肽树脂中加入10mL质量分数为20%的哌啶N，N‑二甲基甲酰胺溶液，室温反应20～40分钟，用砂芯过滤除去溶剂，N，N‑二甲基甲酰胺清洗树脂， 得H2N‑Arg(pbf)‑HN‑ resin；（5）合成NH2‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin肽树脂重复步骤（3）、（4），先对保护精氨酸进行偶联，再对保护谷氨酰胺进行偶联、脱除Fmoc保护，砂芯过滤除去溶剂，得与树脂相连的三肽产物NH2‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽；（6）合成Fmoc‑Glu(tbu)‑COOSu将Fmoc‑Glu(tbu)‑COOH置于反应瓶中，按每克Fmoc‑Glu(tbu)‑COOH加入10～15m L乙酸乙酯，室温搅拌，加入氮羟基丁二酰亚胺，Fmoc‑Glu(tbu)‑COOH与氮羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:1～1.5，搅拌溶解，加入二环己基碳二亚胺,Fmoc‑Glu(tbu)‑COOH与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1～2，室温反应20～24小时，减压过滤除去固体不溶物，滤液减压浓缩至干，得Fmoc‑Glu(tbu)‑COOSu；（7）合成Fmoc‑Glu(tbu)‑ Glu(tbu)‑OH将步骤（6）所得的产物置于反应瓶中，按每克Fmoc‑Glu(tbu)‑COOSu加入10～15mL二氧六环，室温搅拌，至Fmoc‑Glu(tbu)‑COOSu完全溶解；将γ‑叔丁酯谷氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到Fmoc‑Glu(tbu)‑COOSu的二 氧六环溶液中，γ‑叔丁酯谷氨酸与Fmoc‑Glu(tbu)‑COOSu的摩尔比为1.5:1，碳酸氢钠与Fmoc‑Glu(tbu)‑COOSu的摩尔比为2：1，室温搅拌反应18～20小时，用质量分数为5%盐酸溶液调pH为2～3，加乙酸乙酯萃取，分出有机相，有机相依次用水、饱和食盐水洗，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、减压过滤、滤液减压蒸浓缩得Fmoc‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑COOH；（8）合成Fmoc‑Glu(tbu)‑ Glu(tbu)‑COOSu将Fmoc‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑COOH采用步骤（6）所述方法进行反应，得Fmoc‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑COOSu；（9）合成Fmoc‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑COOH将步骤（8）Fmoc‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑COOSu、蛋氨酸采用步骤（7）所述的方法进行反应，得Fmoc‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑COOH；（10）合成Fmoc‑Glu (tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽将步骤（5）合成的NH2‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽溶解于N，N－二甲基甲酰胺中，依次加入Fmoc‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑COOH、O‑苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲四氟硼酸、苯并三氮唑、二异丙基乙胺，NH2‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽与Fmoc‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑COOH、O‑苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲四氟硼酸、苯并三氮唑、二异丙基乙胺的摩尔比为1：2～5：2～5：2～5：6～10，室温反应3～5小时，减压过滤，用N，N－二甲基甲酰胺洗树脂1～3次，得Fmoc‑Glu (tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽；（11）合成H2N‑Glu (tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽用步骤（4）的方法，对Fmoc‑Glu (tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin进行脱除Fmoc保护基团，得H2N‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑ Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽；（12）合成Ac‑HN‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑ Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽在H2N‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑ Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽中加入二氯甲烷、乙酸酐、三乙胺，按每克H2N‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽中加入20mL二氯甲烷，H2N‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽与乙酸酐、三乙胺的质量比为1:0.5:1,室温反应3～5小时，过滤，用N，N－二甲基甲酰胺洗树脂3次，得Ac‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽；（13）制备六胜肽 配制树脂切割液：将苯酚、1,2‑乙二硫醇、苯甲硫醚、三氟乙酸、水按体积比为5:2.5:5:4:83.5加入到烧杯内搅拌混合；切割树脂：在步骤（12）树脂肽中加入切割液，按每克Ac‑Glu(tbu)‑Glu(tbu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin树脂肽加入10～15mL切割液，室温搅拌反应3小时，过滤，滤液倾倒到冷冻的 无水乙醚中，搅拌，离心、分离出上清液，室温减压烘干，得六胜肽粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、冻干得纯度大于95%的六胜肽。 |
