生物素-亲和素系统固定化糖化酶及其制备方法

摘要

本发明公开一种生物-素亲和素系统固定化糖化酶及其制备方法。本发明提供生物素-亲和素系统固定化糖化酶，由以下方法制得：1.磁性琼脂糖微球的制备：①Fe3O4磁性微球的制备，②磁性琼脂糖微球的制备，2.亲和素-磁性琼脂糖微球的制备，3.生物素标记糖化酶的制备：称取1mg生物素溶于2mL、pH4.6醋酸缓冲液中，然后取浓度为4mg/mL糖化酶液2.0ml加入到溶液中，20℃时搅拌2.5h后静置24h。用透析袋进行透析，除去未反应的生物素，得到生物素标记糖化酶。4.生物素-亲和素系统固定化糖化酶。该产品稳定性好、可反复使用、适应连续化、自动化的工业生产、酶的使用效率高。

主权项

生物素‑亲和素系统固定化糖化酶，由以下方法制得(1)磁性琼脂糖微球的制备①Fe3O4磁性微球的制备分别加入35mL 0.5mol/L FeCl3和20mL 0.5mol/L FeCl2溶液于200mL烧杯中，用电动搅拌器搅拌，使溶液混合均匀，置60℃水浴锅中，然后快速滴入2mol/L NaOH溶液直至pH＝6.5，15min后继续缓慢加入NaOH溶液调pH至10～11，其余条件不变，液体由棕色变为黑色即可，再升温至80℃恒温保持1h，停止加热，搅拌冷却，待降至室温后，分别用蒸馏水和乙醇洗涤数次，直至中性，室温下进行真空干燥，干燥温度60℃时间24hr，即得Fe3O4纳米粒子；②磁性琼脂糖微球的制备采用反相悬浮包埋法。分别将28mL三氯甲烷和 72mL甲苯混合，搅拌，加入1.0mL Span‑80混匀，50℃水浴加热，在快速搅拌下加入8％琼脂糖溶液，使琼脂糖在有机相中分散均匀，减慢搅拌速度，自然冷却，过滤，用石油醚清洗3次，用蒸馏水大量冲洗；(2)生物素标记糖化酶的制备称取1mg生物素溶于2mL、pH4.6醋酸缓冲液中，然后取浓度为4mg/mI糖化酶液2.25ml加入到溶液中，20℃时搅拌3h后静置24h。用透析袋进行透析，除去未反应的生物素，得到生物素标记糖化酶；(3)亲和素‑磁性琼脂糖微球的制备取1mg磁性琼脂糖微球，在磁场下用磷酸二氢钠缓冲液洗涤，在50mL烧杯中加入连接液，混匀。室温下摇床中振荡15min，避免磁性微球沉淀，并起混匀作用，磁场下用盐酸缓冲液洗涤，再用磷酸盐缓冲液重悬磁性微球。立即加入亲和素30μg，混匀，室温下振荡20min。磁场下用磷酸盐缓冲液洗涤磁性微球，重悬在磷酸盐缓冲液中；(4)糖化酶的固定化将1mg亲和素‑磁性琼脂糖微球载体加入到5mL pH6.1乙酸‑乙酸钠缓冲溶液中，再加入生物素标记的糖化酶液40μL，20℃振荡30min，用磁铁收集，倒出上清液，用缓冲液充分洗涤，最后于4℃冰箱中保存，即得固定化糖化酶。