一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法

摘要

本发明公布了一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，其步骤：A、藻粉材料：收获野外水华蓝藻或室内培养的铜绿微囊藻冷冻干燥后制成干藻粉；B、固相萃取小柱制备：在SPE柱中装入C18填料；C、藻毒素提取：称取干藻粉，按比例加入甲醇，室温下置于摇床上振荡；D、杂质去除：将上清液与有机萃取剂按比例加入分液漏斗，混合摇匀，静置，分层后弃去有机萃取剂；E、藻毒素分离纯化：预处理后，试样溶液通过预先活化的串联组合的SPE小柱进行富集，用20~50%甲醇水溶液洗脱毒素；F、MC检测。方法分离效果好，上样量大，操作简便，成本低，一次性可得到不小于10mg、纯度较高的二种微囊藻毒素，HPLC-UV/DAD检测达到85~90%。

主权项

一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，其步骤如下：藻粉材料：收获野外水华蓝藻或室内培养的铜绿微囊藻冷冻干燥制成干藻粉，‑20°C保存；固相萃取小柱制备：在SPE柱中装入1g C18型Sunchrom球形硅胶，用垫片压紧后保存待用；SPE柱临用前用30~50mL甲醇和30~50mL水进行活化，SPE柱的串连采用不锈钢针头穿孔橡皮塞进行连接；藻毒素提取：称取20g干藻粉，按20~50ml/g的比例加入75%v/v甲醇水溶液，室温置于摇床上振荡40~120min或在搅拌器上连续搅拌40~120min，取出后以3000~4500r/min的转速离心10~30min，取出上清液；杂质去除：将所得的上清液与有机萃取剂按10:1~1:2的比例加入分液漏斗，混合摇匀，静置15~60min，分层后弃去有机萃取剂，再次加入上述比例的萃取剂重复萃取一次，弃去有机萃取剂；剩余溶液用旋转蒸发器减压蒸发除去有机溶剂，过0.45μm的滤膜用高效液相色谱测定其毒素含量后，进入后续的藻毒素分离纯化步骤；藻毒素分离纯化：预处理后，试样溶液通过预先活化的2~4个串联组合的SPE小柱进行富集，通过调节上样量，使第一个SPE小柱因富积大量色素杂质不能保留微囊藻毒素，即MC；MC被吸附固定于后续的小柱，富集完毕，用100~300mL 5~20%v/v的甲醇水溶液淋洗小柱，淋洗后弃去第一个SPE柱；继续用20~50%v/v的甲醇水溶液洗脱剩余SPE小柱中吸附的微囊藻毒素，上样、淋洗及洗脱的速度控制在2~5mL/min，通过实时监测毒素含量的变化，确定分段收集的洗脱液中含MC的组分及纯度，纯度达85~90%的含目标MC的组分于30~40°C旋转蒸发浓缩至干，用70%v/v甲醇水溶液定容，保存于‑20°C冰箱中；MC检测：采用色谱条件，Phenomenex Synergi 4μm Hydro‑RP 80A，4.6×250mm，流动相：甲醇:0.05%三氟乙酸=62:38等度洗脱，流速1mL/min，检测波长238nm，进样量10μL，根据MC‑LR和MC‑RR标准品的色谱图对纯化的MCs进行定性定量；所述的藻毒素分离纯化步骤中，C18填料富集毒素后，采用低浓度20~50%，v/v的甲醇水溶液洗脱，其中20~30%v/v的甲醇水溶液实现MC‑LR与未知毒素的完全分离，30~50%v/v的甲醇水溶液实现MC‑LR与MC‑RR的完全分离。