一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法

摘要

本发明属于动物肠道粘膜细胞分离和培养领域，具体涉及一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法，包括取材和培养两个步骤：按照常规方法取出鱼的肠道，清除肠道外脂肪，然后采用下述两种方法中的任一种消化分离鱼类肠道粘膜细胞，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液：将所得含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，离心得到粘膜细胞和细胞团的混合物，作为原代培养的接种材料细胞；所述培养步骤中，以鱼皮胶原蛋白作为培养支持载体，以改良的DMEM液作为培养基，以改良的D-Hanks液作为平衡盐溶液，在培养温度26～28℃下，pH7.2-7.4条件下进行原代培养24小时以上即可贴壁生长。采用本发明所得鱼类肠道粘膜细胞生长良好，结构和功能性标志性指标体系完善。

主权项

一种鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，包括取材和培养两个步骤，所述取材步骤包括消化和分离步骤，其特征在于，1）消化步骤具体为：按照常规方法取出鱼的肠道，清除肠道外脂肪，然后采用下述两种方法中的任一种消化分离鱼类肠道粘膜细胞，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液：方法一：使用含抗生素的D‑Hanks液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的一端，向肠道内灌注体积为50%～70%肠道内容积的混合消化液，结扎剩余的肠道一端；然后在25～30℃水浴中消化20～40min，再向肠道加入含质量分数5～6%新生牛血清的DMEM，用镊子提起肠道的两端，反复振荡5～8次，终止消化；放出含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；方法二：将肠道完全翻转，黏膜面朝外，肠壁朝内，使用含抗生素的D‑Hanks液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的两端，将肠道浸没在混合消化液中，在25～30℃水浴中消化20～40min，再向混合消化液中加入含质量分数5～6%新生牛血清的DMEM，反复振荡5～8次，终止消化；取出肠道，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；2）分离步骤具体为：取步骤1）所得含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，在300r/min～500r/min的转速下离心3～5min，得到粘膜细胞和细胞团的混合物，以所得粘膜细胞和细胞团的混合物作为原代培养的接种材料细胞；所述培养步骤中，以鱼皮胶原蛋白作为培养支持载体，以改良的DMEM液作为培养基，以改良的D‑Hanks液作为平衡盐溶液，按照2.3×104个/cm2～4.7×104个/cm2的粘膜细胞和细胞团浓度，将粘膜细胞和细胞团的混合物加入到培养基中，在26～28℃培养的温度下，pH7.2‑7.4条件下进行原代培养，24小时以上即可贴壁生长；其中，所述含抗生素的D‑Hanks的配置方法为：使用前临时在D‑Hanks液中加入抗生素青霉素、庆大霉素、链霉素，并且青霉素浓度为20万U/L、庆大霉素浓度为20万U/L、链霉素浓度为200mg/L；所述混合消化液含胶原酶Ⅰ 0.15～0.3mg/ml、胶原酶Ⅳ0.15～0.3mg/ml；所述改良的DMEM液中包含：2μg/ml 重组人表皮生长因子，2.5mg/ml胰岛素，质量分数8%的新生牛血清，0.85～1.15mg/ml的谷氨酰胺，20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素；使用时用水稀释1.4～1.5倍体积；所述改良的D‑Hanks液的配置方法为：按照常规方法配制D‑Hanks液，并通过改变NaCl的浓度，调节渗透压到225mmol/kg，成为改良的D‑Hanks液，4℃下贮存，使用前用0.22μm过滤除菌。