利用转谷氨酰胺酶酶原生产微生物转谷氨酰胺酶的方法

摘要

本发明公开了利用转谷氨酰胺酶酶原生产微生物转谷氨酰胺酶的方法，包括如下步骤：（1）茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因扩增，在酶原与成熟肽之间引入牛肠激酶的识别序列DDDDK；（2）基因克隆构建表达载体，转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）为工程菌E.coliBL21/proMTG，菌株保藏号为CCTCCM208240；（3）可溶性诱导表达转谷氨酰胺酶酶原；（4）亲和层析纯化蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原；（5）采用牛肠激酶激活酶原为成熟的转谷氨酰胺酶。本发明获得的转谷氨酰胺酶生物活性高；简化了发酵生产工艺，可以特异性完整切除转谷氨酰胺酶酶原序列，不会因非特异性切割或长时间切割导致酶的降解。

主权项

利用转谷氨酰胺酶酶原生产微生物转谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）转谷氨酰胺酶酶原基因的扩增和引入牛肠激酶的识别序列：由茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列设计PCR引物进行PCR扩增，同时利用融合PCR技术在茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原与成熟肽之间引入牛肠激酶的识别序列DDDDK，获得带有牛肠激酶识别序列的表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段；（2）通过基因克隆构建表达载体：将步骤（1）得到的基因片段通过NdeI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET22b(+)中，构建表达载体pET22b‑proMTG，并转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3）成为工程菌E.coli BL21/proMTG，该菌株保藏编号为CCTCC M208240；（3）可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原：将步骤（2）得到的工程菌E.coli BL21/proMTG先活化培养，然后接种到新鲜的培养基中，发酵生长后降低温度到22~24℃，然后加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，诱导表达后收集菌体；（4）蛋白纯化工艺：对步骤（3）收集的菌体用超声破碎裂解细胞后离心，上清液用亲和层析柱纯化蛋白，用500μmol/L的咪唑洗脱目的蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原蛋白；（5）转谷氨酰胺酶酶原的激活：采用牛肠激酶作为激活剂，将表达的转谷氨酰胺酶酶原激活为成熟的转谷氨酰胺酶。