一种用于检测白血病病毒载量的标准品及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，以及用该标准品通过实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-time RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒载量的方法。在检测过程中包括白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定、用引物对逆转录扩增获得核酸片段、实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-time PCR)检测等步骤，本发明检测Friend鼠白血病病毒载量与常规PCR检测方法相比，具有较好的特异性，所检测的基因扩增产物为欲检测的目的基因产物，并且具有较好的线性关系，适合应用于对Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的检测。

主权项

一种用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，其特征在于该标准品由如下方法制成：(1)制作病毒液：将Friend鼠白血病病毒按1∶10用磷酸盐缓冲溶液稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含0.1重量份脾脏的悬液，在4℃下以2×103r/min的速度离心10‑15min，取上清液作为病毒液，备用；(2)制作标本：取小鼠，用上述病毒液腹腔注射，感染小鼠，解剖取脾组织，冻存于‑80℃，备用；(3)白血病病毒核酸的提取及含量测定总RNA提取：将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50～100mg小鼠脾组织加入1mlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min；移上清液入1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育2～3min；于4℃下以12000rpm的速度离心15min；移上层水相到1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入1ml 75％乙醇，于4℃下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA；总RNA含量测定：总RNA用DEPC处理水稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、OD260值、OD260/OD280、蛋白质含量，OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA保留，备用；(4)逆转录反应将上述提取的RNA用30μl焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA；(5)标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应扩增，其中使用的引物对是：5′‑CGTGTTCAACGCTCTCAAAA‑3′和5′‑CAAGTCCACAGAGGGTGGTT‑3′；上述引物依次如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示；将扩增完毕的PCR产物进行1.5％的5×Tris‑硼酸琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值，计算每ml PCR产物的拷贝数，公式为：拷贝数/ml＝6.02×1023×C×A260/MW1，其中C＝5×10‑5/ml，MW1＝PCR产物的分子量＝碱基数×6.58×102，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml 1.0×1010拷贝，得标准品。