检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸及其检测方法

摘要

本发明属于生物毒素检测技术领域，尤其涉及一种检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸及其检测方法。检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其包括胶体金标记垫、检测线，胶体金标记垫所包被物质为一种生物毒素抗体或多种生物毒素抗体的胶体金标记物的混合物，检测线的条数与胶体金标记垫包被生物毒素抗体的数目相应，每条检测线上分别包被有与胶体金标记抗体相应的单一的生物毒素检测用抗原。本发明的胶体金免疫层析试纸特异性强；操作简单方便，对牛奶、动物尿液可直接检测，饲料、小麦、玉米、大麦等样品简单处理后即可检测，3-5min以后便可观察结果。本方法适用面宽，能满足食品安全、饲料安全及检测机构快速检测生物毒素残留的需求。

主权项

呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1四联胶体金免疫层析检测试纸，其包括在底板上依次粘贴的样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反应区及吸收垫，检测反应区上设有包被有检测用抗原的检测线和包被有二抗的质控线，其特征在于：胶体金标记垫所包被的物质为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1抗体的胶体金标记物的混合物，所述的检测线的条数为四条，分别为T1、T2、T3、T4，每条检测线上分别包被有与胶体金标记抗体相应的呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1检测用抗原，检测用抗原的浓度为0.5‑2.0mg/mL，T4距离检测区底部4‑6mm；质控线包被有浓度为0.5‑1.5mg/mL 的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部4‑6mm；C线与T1，T1与T2，T2与T3，T3与T4两条线之间间隔 2‑4mm；上述的呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1检测用抗原制备方法如下：a、玉米赤霉烯酮偶合抗原的合成方法如下：取10‑20mg 载体蛋白溶于1mL的水中，取玉米赤霉烯半抗原0.01‑0.04mmol溶于二氧六环中，将上述两种溶液缓慢混合；取碳化二亚胺0.02‑0.04mmol，溶于 lmL水中，逐滴加到混合液中，在 20‑25℃下，搅拌反应过夜，用盐酸调PH=6.0，再次加入0.01‑0.02mmol 碳化二亚胺，后放于 4℃ 冰箱内24～28h，反应完成后将反应液装入透析袋，4℃下，pH=7.4 的PBS中透析，分装，冷冻保存备用；b、呕吐毒素抗原的合成方法如下：将10‑40mg呕吐毒素溶解在0.1‑0.8 ml吡啶中，加入到10ml的反应瓶中，在反应瓶中加入30‑120mg的硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，再加入30‑120mg琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌2‑3h，将吡啶在室温吹干后，加入5mL乙酸乙酯溶解残余物，离心，取上清液，室温吹干后，加入NHS、DCC溶于DMF中，室温振荡30‑60min，离心，取上清液，将上清液缓慢滴加到载体蛋白液中，在4℃振荡反应4h，然后，在0.01M PBS PH7.4 中透析，分装，冷冻保存备用；c、伏马菌素B1抗原的合成方法如下：取10‑40mg 载体蛋白，伏马菌素B1 0.01‑0.04mmol溶于0.02M PBS PH=7.4中,室温下搅拌混匀；再缓慢加入0.02‑0.06 mmol的戊二醛，混合物在室温下搅拌过夜, 反应完成后将反应液装入透析袋， 4℃ 下，pH=7.4 的PBS中透析，加入 0.01‑0.04mmol的伏马菌素B1，后放于 4℃ 冰箱内24h，再加入0.01M Tris继续搅拌4h，反应完成后将反应液装入透析袋，在4℃下透析，分装，冷冻保存备用；d、赭曲霉毒素A抗原的合成方法如下：取20‑40mg 载体蛋白，赭曲霉毒素A 0.02‑0.04mmol溶于0.02M PBS PH=7.4中,室温下搅拌混匀；再缓慢加入0.03‑0.06 mmol的戊二醛，混合物在室温下搅拌过夜, 反应完成后将反应液装入透析袋， 4℃ 下，pH=7.4 的PBS中透析，透析完成后，分装，‑20℃冷冻保存备用；所述的呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1抗体采用抗体单克隆抗体，所述的单克隆抗体制备方法如下：（1）免疫动物：取健康6‑10周龄雌性二级 Balb/c 小鼠 6 只进行免疫；第一次基础免疫将0.5‑1.0mg/mL 生物毒素免疫用抗原与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行皮下多点注射，注射量 0.1‑0.3mL/点；三周后开始进行加强免疫，剂量同上，佐剂换为不完全弗氏佐剂，二免后，定期测定抗体效价，每隔三周加强免疫一次，末次免疫 3d 后取脾脏融合；（2）脾细胞悬液的制备：效价高的小鼠，拉颈处死，70％酒精浸泡消毒10min，用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔，在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数；（3）细胞融合和克隆化：取对数生长的骨髓瘤细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次；同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次；将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,5‑10分钟；弃上清，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动；在室温下融合:加入预热的1ml 50%PEG，边加边搅拌；加预热的不完全培养液，终止PEG作用；离心，弃上清，先用6ml左右20％小牛血清轻轻混悬；将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2条件下培养；融合一天后，加HAT选择培养液；融合后 7d ，用 HT 培养液换液 1 次，在 13d 后根据增殖情况改用 20 % NBS 的完全培养液；待集落长至孔底 1/3 时，可取上清检测相应的特异性抗体；细胞完全克隆化后，将细胞注入小鼠腹腔，将腹水用蛋白 A 免疫亲和层析纯化后，即得到生物毒素单克隆抗体；所述的胶体金标记垫的制备包括以下的步骤： （1）胶体金溶胶的制备：取250ml三角瓶一个，加100 ml 超纯水及1ml1%氯化金，加热沸腾；取2ml的1%柠檬酸钠加入上述溶液中；混匀，再保持沸腾30 min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，即为胶体金溶胶；（2）胶体金标记生物毒素抗体：磁力搅拌下，用 0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按10‑20μg抗体/ml胶体金加入生物毒素抗体，继续搅拌混匀30min ，加入10%BSA至终浓度为0.5% ，静置30min；12000rpm、4 ℃离心30min，弃上清，沉淀用1/20初始胶体金体积的0.02M pH9.0的硼酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液配方：硼酸0.1237g, PEG‑20000 1g，用超纯水水定容至1L ，调pH至9.0；重悬，置4℃备用，有效期 60 天；(3)胶体金标记垫处理：将标记好的抗体倒入一槽中，将玻璃纤维纸浸入 lmin ，取出，室温干燥。