一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法

摘要

本发明公开了一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法。MISSA系统由菌株和载体组成。菌株包括供体菌和受体菌，载体包括供体载体和受体载体。供体菌染色体上携带的复制起始蛋白负责自杀式供体载体的复制扩增，携带的接合转移蛋白Tra负责供体载体的接合转移。受体菌能够诱导表达两套位点特异性重组蛋白：Cre重组酶和λ噬菌体位点特异性重组蛋白。当混和供体菌和受体菌时，供体菌和受体菌发生接合生殖，供体菌中的供体载体由于携带oriT元件而转移到受体菌中；在受体菌中供体载体和受体载体在两套位点特异性重组酶的作用下发生重组反应，导致供体载体上携带的目标基因组装到受体载体上。重复上述过程，即可把多个目标基因按预订的方向和顺序组装到受体载体上。

主权项

一种构建同时表达两个以上基因的重组表达载体的方法，包括交替进行的两组重组；第一组重组：将类型I供体菌与类型I受体菌共培养，类型I供体菌中的目标基因整合到类型I受体菌中的类型I受体载体上，得到重组菌；第二组重组：将类型II供体菌与类型II受体菌共培养，类型II供体菌中的目标基因整合到类型II受体菌中的类型II受体载体上，得到重组菌；两组重组各进行一次以上，将两个以上目标基因组装到同一受体载体上；所述类型I受体菌为如下(a)或(b)：(a)将所述类型I受体载体导入出发菌A得到的重组菌；(b)所述第二组重组得到的重组菌；所述类型II受体菌为如下(c)或(d)：(c)将所述类型II受体载体导入出发菌A得到的重组菌；(d)所述第一组重组得到的重组菌；所述类型I受体菌在所述第一组重组后转变为所述类型II受体菌；所述类型II受体菌在所述第二组重组后转变为所述类型I受体菌；所述类型I受体载体在所述第一组重组后转变为所述类型II受体载体；所述类型II受体载体在所述第二组重组后转变为所述类型I受体载体；所述类型I受体菌和/或所述类型II受体菌中，所述出发菌A为满足如下条件的大肠杆菌：含有Cre重组酶编码基因和λ噬菌体位点特异性重组蛋白编码基因；所述类型I受体载体满足如下条件：容量为100‑300kb、单拷贝、含有loxP‑attR2框；loxP‑attR2框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attR2位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attL2位点发生特异性重组；所述类型II受体载体满足如下条件：容量为100‑300kb、单拷贝、含有loxP‑attL1框；loxP‑attL1框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attL1位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attR1位点发生特异性重组；所述类型I供体菌是将类型I供体载体导入出发菌B得到的；所述类型I供体载体满足如下条件：不能在受体菌中复制、含有接合转移必须元件oriT和loxP‑attL1‑attL2框、目标基因位于attL1位点和attL2位点之间；loxP‑attL1‑attL2框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attL1位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attR1位点发生特异性重组，形成attB1位点；attL2位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attR2位点发生特异性重组，形成attB2位点；所述类型II供体菌是将类型II供体载体导入出发菌B得到的；所述类型II供体载体满足如下条件：不能在受体菌中复制、含有接合转移必须元件oriT和loxP‑attR2‑attR1框，目标基因位于attR1位点和attR2位点之间；loxP‑attR2‑attR1框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attR1位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attL1位点发生特异性重组，形成attB1位点；attR2位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attL2位点发生特异性重组反应，形成attB2位点；所述类型I供体菌和/或所述类型II供体菌中，出发菌B为满足如下条件的大肠杆菌：含有接合转移蛋白Tra的编码基因和自杀载体的复制起始蛋白的编码基因；所述出发菌B为大肠杆菌BW20767；所述出发菌A为将pAH57‑cre转化大肠杆菌DH10B得到的重组菌；所述pAH57‑cre的制备方法如下：以序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA为引物，以大肠杆菌SW106的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶BstXI和NheI酶切，得到酶切产物；用限制性内切酶BstXI和NheI酶切pAH57，得到载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒pAH57‑cre；所述类型I供体载体为如下(1)或(2)或(3)：(1)将目标基因插入载体pL‑ccdB的attL1位点和attL2位点之间得到的重组质粒；所述载体pL‑ccdB的核苷酸序列如序列表的序列1所示；(2)将目标基因插入载体pLC‑ccdB的attL1位点和attL2位点之间得到的重组质粒；所述载体pLC‑ccdB的核苷酸序列如序列表的序列2所示；(3)通过Gateway BP反应将目标基因插入载体pP‑ccdB的attP1位点和attP2位点之间得到的重组质粒；所述载体pP‑ccdB的核苷酸序列如序列表的序列5所示；所述类型II供体载体为如下(4)或(5)或(6)：(4)将目标基因插入载体pR‑ccdB的attR1位点和attR2位点之间得到的重组质粒；所述载体pR‑ccdB的核苷酸序列如序列表的序列3所示；(5)将目标基因插入载体pRG‑ccdB的attR1位点和attR2位点之间得到的重组质粒；所述载体pRG‑ccdB的核苷酸序列如序列表的序列4所示；(6)通过Gateway BP反应将目标基因插入载体pPr‑ccdB的attP2位点和attP1位点之间得到的重组质粒；所述载体pPr‑ccdB的核苷酸序列如序列表的序列6所示。