多功能乳酪蛋白活性肽的集成制备方法

摘要

本发明涉及一种多功能乳酪蛋白活性肽的集成制备方法。本发明以乳酪蛋白为原料，采用蛋白酶进行水解，采用4～6kDa超滤膜将各种活性肽从反应体系中分离出来；再采用1～2kDa超滤膜进行分级；根据磷酸肽主要带负电荷，而抑菌肽带较多正电荷，采用离子交换层析进行分离可同时获得抑菌肽、磷酸肽和降压肽，采用喷雾干燥或冷冻干燥获得各种活性肽产品。最后采用液质联用对磷酸肽、抑菌肽和降压肽进行序列鉴定。本发明最大限度地开发利用乳酪蛋白水解产物，解决当前仅制备单一种类活性肽造成资源浪费、活性肽生产成本高的现有工艺问题。

主权项

一种乳酪蛋白活性肽的集成制备方法，其特征在于它包括的步骤：1)乳酪蛋白的溶解：将乳酪蛋白溶解在pH为8.0的碱性溶液中，配制成10‑30g/L的蛋白溶液；2)酶解：将蛋白溶液置于持续搅拌且恒温30‑50℃的酶膜或间歇生物反应器中，按照酶与底物的质量比为1∶10‑1000加入蛋白水解酶，开始反应并计时，在水解的过程中通过滴加碱或酸维持反应体系的pH为8.0，并计算水解度；所述的蛋白水解酶为胰酶；3)一级膜分离：将步骤2)获得的酶解液置于5kDa膜分离装置中，通过超滤膜过滤截留分子量较大的底物和蛋白酶，得到低于5kDa分子量的水解产物；4)二级膜分离：将步骤3)获得的低于5kDa分子量的水解产物置于1kDa膜分离装置中进行过滤，分别得到分子量较大的截留液和分子量低于1kDa的渗透液；5)离子交换层析制备磷酸肽和抑菌肽：将步骤4)获得的截留液，分子量大于1kDa，在阳离子交换层析柱SP650M系统中上样，采用不同离子强度的流动相进行梯度洗脱，收集各个洗脱时间的组分；洗脱条件：流动相A为10mM柠檬酸缓冲液，pH 3.0；流动相B为10mM柠檬酸缓冲液，1mol/L NaCl，pH 3.0；梯度条件为0～2.5CV的100％A，2.5～12.5CV的100％A～45％A，12.5～16CV的100％B，CV为柱体积；上样流速为2mL/min；洗脱流速为10mL/min；6)层析分离制备降压肽：将步骤4)获得的分子量低于1kDa的渗透液在阳离子交换层析柱SP650M或Sephadex G‑15凝胶排阻层析柱中上样，收集各个洗脱时间的组分；洗脱条件：流动相为超纯水；流速为4mL/min，检测波长为215nm；7)干燥：将步骤5)和6)获得的不同层析组分进行收集，将其喷雾干燥或冷冻干燥，获得相应的活性多肽产品；8)磷酸肽、抑菌肽和降压肽的序列鉴定：将步骤5)‑7)获得的样品溶于0.1％三氟乙酸溶液中，采用液质联用技术和Sequest数据库检索对活性肽的序列进行鉴定；9)活性肽的功能测定：磷酸肽主要测定其氮磷比；抑菌肽主要测定其抑制金黄色葡萄球菌的能力；降压肽主要测定其抑制血管紧张素转换酶ACE活性的能力。