构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法

摘要

本发明公开了一种构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，包括精确孕期小鼠的获取、胚胎性别鉴定、生殖结节的切取和培养、培养生殖结节的鉴定等步骤。本发明路线合理，易操作，为进一步研究阴茎尿道发育机制和外生殖器畸形的发病机制提供了有效工具。

主权项

1.一种构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特征是：包括下列步骤：(1)精确孕期小鼠的获取：取8-10周龄近交系小鼠，于晚上按雌雄4∶1合笼，第二天早上分笼，分笼时观察雌鼠阴道内阴栓情况，以阴道口看见白色浆液性栓子者为交配成功，予以分开饲养，定为孕0.5d计算，交配未成功者可予以再交配；(2)胚胎性别鉴定：采用处死后解剖法或PCR法进行性别鉴定；(3)生殖结节的切取和培养：①断颈处死孕鼠，将其固定于取材板上，75％酒精消毒皮肤，剖开腹部及子宫，取出胎鼠放入培养皿中；②解剖显微镜下寻找到生殖结节，于其根部用膜状内障剪迅速剪下，将离体生殖结节迅速转移至培养液中；③将-CM插入式细胞培养皿预先放入BGJB培养液中37℃浸泡30分钟，然后在6孔板中每孔加培养液1.1ml，放入-CM板；④将待培养的生殖结节放置于-CM板的微孔膜上，保留生殖结节表面的液膜；⑤每块-CM板的微孔膜上均匀放置4～5枚生殖结节；⑥将6孔板放入CO₂培养箱中，24小时换液一次，每次换液注意调节液面，使得生殖结节一直处于气液相交界处；⑦培养分组：将生殖结节分成加生理浓度10nM DHT的DHT组及不加DHT的无DHT组；(4)培养生殖结节的鉴定：采用生殖结节培养前后形态和大小测量方法、生殖结节激光共聚焦三维成像方法、生殖结节冰冻切片HE染色法中至少一种进行鉴定。