快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA方法及其应用

摘要

本发明公开了一种快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA方法及其应用。田间烟粉虱的采集、预处理及研磨后，利用番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，建立检测传毒介体烟粉虱的dot-ELISA方法，并研发快速检测试剂盒，对田间烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的情况进行检测。利用该发明可对田间烟粉虱的带毒率进行大规模调查，预测田间番茄黄化曲叶病的流行爆发趋势。该检测方法快速高效、灵敏特异、高通量又操作简便，为番茄黄化曲叶病毒病的快速诊断、预测预报及科学防控提供技术支撑。

主权项

一种快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot‑ELISA方法，其特征在于包括如下步骤：1）田间烟粉虱的采集、预处理及研磨；2）硝酸纤维素（NC）膜准备：用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格1×1 cm，平整放入培养皿中央；3）点样：吸取研磨的烟粉虱研磨液2 µL，点样于NC膜的格子中央；4）封闭：点样后，将NC膜静置晾干10分钟，使用按5 g脱脂奶粉加100 mL PBST缓冲液的比例配制得到5%的脱脂奶粉封闭，37℃静置0.5‑1小时；所述的PBST缓冲液为含0.05% Tween‑20的0.01 mol/L PBS； 5）加一抗：加入中国专利申请号为201210004197.7的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体用5%的脱脂奶粉1:2000倍稀释, 37℃孵育1小时；6）洗涤：弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5次，每次3分钟；7）加酶标二抗：弃洗脱液，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脱脂奶粉1:1000倍稀释，37℃孵育1小时；8）洗涤：弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5~6次，每次5分钟；9）显色：弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干，加入TMB显色液显色，避光静置5~10分钟；10）终止反应：待NC膜上的样品呈现蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；11）记录结果：ddH2 O浸泡NC膜，晾干后记录结果。