基于已知E1查找特异性介导靶蛋白泛素反应E2-E3的方法

摘要

本发明涉及生物化学与分子生物学领域。具体而言，特指一种从人体细胞众多E3中查找出特异性识别靶蛋白泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化反应的E2/E3系统的方法。该方法是先建立体外泛素化分析系统，通过已知的泛素活化酶E1和以HelaS100馏分作为E3源，筛选出介导靶蛋白泛素反应的结合酶E2；再采用多重层析柱组合，结合质谱分析，从人体细胞中查找特异性识别靶蛋白的泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化修饰的E2/E3系统。通过这种方法，可以方便、准确地查找出识别靶蛋白的底物识别因子－泛素连接酶E3；建立介导靶蛋白泛素化修饰的E2/E3调控系统。

主权项

基于已知泛素活化酶E1查找特异性介导靶蛋白泛素反应结合酶E2和连接酶E3的方法，包括以下步骤：（1）建立泛素化修饰反应的体外分析系统和E2的确定：泛素反应的体外分析系统是以经纯化的GST融合靶蛋白作为基质，GST为对照，还包括：泛素，一种已知的活化酶E1，结合酶E2，未知的连接酶E3，Ubiquitin aldehyde，ATP能量再生系统；E2的确定过程是将以上反应混合物于反应缓冲液中300C下反应60分钟；反应完成后，用Glutathione珠回收GST融合蛋白或GST的耦合物，SDS‑PAGE电泳并转膜后，以抗泛素的抗体Western Blot检测靶蛋白‑泛素耦合物，从待选的多种E2中筛选出在已知E1情况下介导靶蛋白多泛素化反应最强的、与未知E3配对的E2；（2）对特异性识别靶蛋白的E3进行查找：人体细胞抽提液经过免疫亲和层析柱、Phenyl Sepharose疏水层析柱、Mono Q离子交换层析柱和Superdex 200分子筛层析柱4个不同性质的层析柱，每一步层析后，运用上述所建立的泛素反应体外分析系统，对各洗脱馏分检测E3的活性，合并含E3活性的洗脱馏分峰，再通过下一个层析柱，在最后一步层析后，对含E3活性馏分峰进行质谱鉴定，确定出特异性识别靶蛋白的E3。