一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法

摘要

本发明涉及一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，介孔材料固定化蛋白，装入色谱柱，制备固定化靶蛋白抑制剂筛选模型，将对靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制剂溶于缓冲液作为流动相，每隔固定的时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分，固定次数后将流动相换成不含抑制剂的缓冲液，每隔固定时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分，所述馏分分别冷冻干燥，溶于水，用分析型色谱柱分离底物和产物，纪录产物的峰面积；绘制固定化靶蛋白抑制剂的抑制曲线，对模型进行验证，再采用制备的模型将待筛选中药水提物溶于缓冲液中作为流动相。根据产物的峰面积判断中药是否有抑制作用以及抑制的过程、类型。该方法具有可靠性高、在线等优点。

主权项

一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A：制备固定化靶蛋白：采用物理吸附法，将靶蛋白溶于的最适pH的缓冲液中，加入介孔材料，冰浴条件下搅拌孵育；步骤B：制备固定化靶蛋白抑制剂筛选模型：以水为流动相，将步骤A所述固定化靶蛋白装入色谱柱中，构成固定化靶蛋白抑制剂筛选模型；步骤C：验证步骤B制备的固定化靶蛋白抑制剂模型的有效果性；首先，选择对靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制剂；再将步骤B制备的固定化靶蛋白抑制剂模型连接液相色谱仪，将一定量的固定化靶蛋白抑制剂溶于与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第一流动相；其次，开启液相色谱仪，用所述第一流动相平衡柱子，每隔固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻出峰第一馏分；进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数后，将所述的第一流动相换成不含固定化靶蛋白抑制剂的与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液，每隔固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻出峰第二馏分；最后，收集的不同时刻出峰第一馏分和不同时刻出峰第二馏分分别冷冻干燥，溶于水，用分析型色谱柱分离底物和产物，纪录不同时刻出峰第一馏分产物及不同时刻出峰第二馏分产物的峰面积。步骤D：重复步骤A和步骤B的步骤，将步骤B制备的固定化靶酶抑制剂模型连接液相色谱仪，将与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第二流动相；开启液相色谱仪，用所述的第二流动相平衡柱子后，固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物，收集不同时刻出峰第三馏分，所述出峰第三馏分冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分离底物和产物，纪录不同时刻出峰第三馏分产物峰面积；步骤E：固定化靶蛋白抑制剂的抑制曲线：以时间为横坐标，以靶蛋白的残余活力为纵坐标，制作随时间改变，靶蛋白经历活性被抑制或激活和活性恢复的过程曲线；所述残余活力为不同时刻出峰第一馏分产物峰面积或不同时刻出峰第二馏分产物峰面积与不同时刻出峰第三馏分产物峰面积之比；步骤F：参照上述步骤A至步骤E中的方法，将方法中的靶蛋白抑制剂换成天然药物，筛选天然药物中活性成分，考察其对靶蛋白的抑制作用及抑制类型。