利用家畜乳腺高效生产人溶菌酶

摘要

本发明涉及利用家畜乳腺高效生产人溶菌酶，公开了一种乳腺特异性表达的融合基因，该融合基因从5’至3’依次包含以下元件：牛β-乳球蛋白基因的5’侧翼序列，人溶菌酶基因，和牛生长激素基因3’侧翼序列。本发明还公开了一种制备转基因动物的方法。本发明还公开了一种高效安全的去除标记基因的转基因家畜制备方法。

主权项

一种制备转基因动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将一融合基因转染体细胞，获得基因组中整合有融合基因的转基因细胞，其中所述的融合基因从5’至3’依次包含以下可操作性相连的元件：牛β‑乳球蛋白基因的5’侧翼序列，人溶菌酶基因，和牛生长激素基因3’侧翼序列，并且，所述的人溶菌酶基因选自：(a)具有SEQ ID NO：5中1267‑6067位的核苷酸序列；或(b)与(a)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或所述的牛β‑乳球蛋白基因的5’侧翼序列选自：(a1)具有SEQ ID NO：5中1‑1260位的核苷酸序列；或(b1)与(a1)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或所述的牛生长激素基因3’侧翼序列选自：(a2)具有SEQ ID NO：5中6074‑6304位的核苷酸序列；或(b2)与(a2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；并且，在步骤(a)中，在将所述的融合基因转染体细胞的同时，还包括：将一用于抗性筛选的基因转染体细胞，获得基因组中整合有所述融合基因以及抗性标记基因的转基因细胞；并且，所述的用于抗性筛选的基因从5’至3’依次包含以下元件：Loxp，新霉素抗性基因，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因，Loxp；(b)将所获得的转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得可高产人溶菌酶的动物；并且在步骤(a)与(b)之间，还包括步骤：(a1)用细胞穿透型Cre重组酶处理所述的转基因细胞，从而获得删除了所述抗性标记基因的转基因细胞；其中，所述的细胞穿透型Cre重组酶是：细胞穿透肽和Cre重组酶的融合蛋白；所述的动物是山羊,并且所述方法还包括步骤：对所述转基因山羊进行基因型鉴定，从而获得不含有抗性基因新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因tk的转基因动物，鉴定方法包括：取所述山羊的耳尖组织，原代培养获得耳成纤维细胞，通过G418敏感性实验鉴定是否不含新霉素抗性基因neo;以及进行基因组DNA的PCR，从而鉴定是否不含抗性基因新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因tk。