一种适用于转人乳铁蛋白基因牛的快速简便检测方法

摘要

本发明属于转基因成分的检测技术领域，涉及一种转人乳铁蛋白基因牛的转基因成分的快速检测方法。本发明与环介导等温扩增反应有关。步骤是：(1)引物设计：根据人乳铁蛋白基因序列设计特异引物，该引物的序列如SEQID NO：1-4所示。(2)建立环介导等温扩增反应方法，即以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人乳铁蛋白基因进行恒温扩增，得特异扩增片段。(3)对环介导恒温扩增产物进行分析：采用琼脂糖凝胶电泳和荧光染料染色对扩增产物进行分析，根据凝胶成像观察是否出现梯形条带，判定是否含有转基因成分；或在日光下肉眼观察将环介导等温扩增产物的结果。本发明简便，快速，特异性强，且成本较低，适合基层应用。

主权项

一种转人乳铁蛋白基因牛的快速、简便检测方法，其步骤包括：(1)引物设计及合成：根据人乳铁蛋白的基因序列设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示：FIP：5’‑CCACCTCCTTAGTGGAGTGAAGTGGTGCGAGGCCT‑3’；BIP：5’‑TTCTCAGGGCTGTTCTTGGTAGCTAAGGAAAAGAGGA‑3’；F3：5’‑AGATGGCAGATGGTAGGAGGT‑3’；B3：5’‑TGCGACAAAAGGGCAGACA‑3’。(2)环介导等温扩增反应：以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人乳铁蛋白基因进行恒温扩增，其反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg2+2mM，8U Bst NDA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，于95℃反应5min，反应后立即冰浴1‑2min，加入8U Bst NDA聚合酶，于61℃反应60min，80℃下反应5min后终止反应；(3)环介导恒温扩增产物分析：1)琼脂糖凝胶电泳：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液，该缓冲液包含浓度40％甘油，0.2％溴酚蓝，59.8％0.25M Tris‑Hcl，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，得到凝胶成成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则判定为含有人乳铁蛋白基因，即含有转基因成分，若没有阶梯型条带则判定为不含人乳铁蛋白基因；2)将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。