非限制性构建无缝质粒表达载体的方法

摘要

本发明涉及一种非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，属于基因工程或分子生物学技术领域。在构建重组质粒实验过程中，经常遇到需要将两个基因片段融合并确保得到的质粒能正确表达所需要的氨基酸序列，但因所使用的载体中无合适的酶切位点，导致常规的内切酶处理-连接酶连接的方法不适用。本发明通过USER酶的使用，分别在目的片段与载体两端产生粘性末端，可以将目的基因片段非限制性的插入或置换任何载体的任何部位，无需额外加入任何碱基；同时确保融合基因开放阅读框的正确性。本发明的优势为：构建重组质粒时不受到载体质粒和目的基因片段酶切位点的限制，为非限制性载体构建，并且获得阳性重组子的效率高。

主权项

非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，包括如下步骤：(1)依据目的片段的DNA序列和载体质粒的DNA序列，写出重组质粒的DNA序列；(2)PCR引物设计：设计两对含有dU的PCR引物；a.第一对引物用于扩增目的DNA片段：设计方法是根据重组质粒DNA序列在插入目的DNA片段与质粒载体之间5′端和3′端靠近接缝处各找一长度为6‑11个碱基序列作为5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区；5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区是第一个碱基为A，最后一个碱基为T的DNA序列；设计正向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补；b.第二对引物是用来扩增质粒载体：正向引物设计方法是使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补；(3)PCR扩增：使用上述设计的两对引物，分别以含有目的DNA片段的质粒和载体质粒作为模板，采用高保真度DNA聚合酶进行PCR扩增分别得到目的片段DNA和质粒载体DNA；PCR产物用20个酶活单位的Dpn I酶37℃水浴1‑2h以去除模板DNA；(4)用USER酶处理步骤(3)产物：取10个酶活单位的USER酶加入步骤(3)Dpn I酶处理后无需纯化的产物中，37℃水浴1‑2h后6‑11个碱基的DNA片段会自动脱落，产生目的DNA片段和质粒载体相匹配的粘性末端；(5)将步骤(4)得到的具有粘性末端的目的DNA片段和质粒载体的混合物按体积比3∶1的比例混合转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化的细胞涂到含抗生素的培养基平板上筛选阳性菌落；(6)用菌落PCR方法鉴定阳性菌落，挑取阳性克隆子送测序中心测序。