适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法

摘要

适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法属农田害虫防控技术领域，本发明包括：将亚洲玉米螟幼虫体表消毒，收集血淋巴，每200ul血淋巴中加入10mgN-苯基硫脲；将血淋巴离心取上清分装，每管中加入80ul 50％的PEG，终浓度为40％，震荡混匀，冰浴1h；离心弃上清，沉淀中加入4倍体积冷丙酮悬浮震荡混匀，冰浴30min；将亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物溶解于水化／裂解缓冲液后，离心取上清液，得到亚洲玉米螟幼虫蛋白双向电泳样品液。采用本发明制备亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品快速、简易，且可获得高质量、重复性好的双向电泳图谱，便于进行后续生物质谱分析鉴定蛋白的研究，本发明可广泛应用于亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白质组学研究，具有较高的实用价值。

主权项

一种适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法，其特征在于包括下列步骤：1)用75％酒精对亚洲玉米螟幼虫进行体表消毒，在‑20℃冰冻10min；2)取出亚洲玉米螟幼虫，在不破坏消化道的前提下，用无菌剪剪掉幼虫腹足，挤压腹部，再用10ul的移液枪吸取透明的血淋巴，在冰上快速将其放入离心管中；3)将吸取后的亚洲玉米螟放入底部设有小孔的0．5ml的锥形离心管，再将锥形离心管插入1．5ml离心管中，在4℃条件下8000×g离心10min后，从1．5ml离心管底部收集血淋巴，每200ul血淋巴中加入10mgN‑苯基硫脲；4)将收集好的血淋巴在4℃条件下5000×g离心5min，取上清，按每管20ul分装，每管中加入80ul 50％的PEG，使PEG的终浓度为40％，震荡混匀30s，放冰上冰浴1h；5)在4℃条件下15000×g离心15min，弃上清，每管沉淀中加入600ul100％的冷丙酮悬浮震荡混匀，放冰上冰浴30min；6)在4℃条件下15000×g离心15min，弃上清，每管沉淀中加入600ul 80％冷丙酮悬浮震荡混匀，放冰上冰浴30min，在4℃条件下15000×g离心15min，真空离心干燥1min，得到亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白的粗提物；7)将亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化／裂解缓冲液混合，在30℃条件下水浴30min，促进蛋白的溶解，然后在4℃条件下15000×g离心5min，收集上清液，即得到适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品液。