一种微小RNA实时定量PCR检测方法及其应用

摘要

本发明公开了一种微小RNA实时定量PCR检测方法及其应用。本发明通过设计与靶miRNA3’端序列互补的逆转录引物进行逆转录反应得到cDNA序列，然后设计第一正向引物进行overlapPCR反应，cDNA序列被延伸；最后，延伸的逆转录产物通过传统的TaqManPCR进行扩增、定量。该检测方法在低、中、高三个不同模板RNA浓度水平的批内、批间重复性较好，而且检测方法灵敏。

主权项

一种微小RNA实时定量PCR检测方法，包括如下步骤：（1）设计与靶microRNA3’端互补的引物，进行逆转录反应，得到cDNA；（2）设计第一正向引物与cDNA5’端部分序列进行杂交，进行Overlap PCR反应，得到5’端延长有外源DNA序列的双链DNA产物；（3）设计第二正向引物、特异的探针和反向引物，进行荧光定量PCR反应；其中步骤（2）中所述第一正向引物长40～50bp,其3’端前15～20个碱基序列与靶microRNA5’端互补；步骤（3）中设计的特异的探针序列位于靶microRNA经逆转录得到的cDNA与外源DNA序列连接部位。