一种改良的酚-氯仿法提取真菌DNA

摘要

本发明提供了一种改良的酚-氯仿法提取真菌DNA，所述的方法包括真菌细胞裂解、蛋白质消化分离、DNA萃取等步骤；本发明所述的方法是利用SDS、蛋白酶K等化学物质的有效组合，通过水饱和酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂的沉淀后，用分光光度计测定OD260/OD280值接近于标准值，可直接应用于分子操作，该方法可以应用于各种真菌的DNA提取，解决了其他常见真菌DNA提取方法仅仅对某一种真菌有良好效果的问题，在真菌的DNA提取领域具有重大应用前景。

主权项

一种真菌DNA的酚‑氯仿改良提取方法，适于酵母样真菌和丝状真菌DNA的提取，包含如下的步骤：A)试剂制备方法：STE缓冲液：将1.169g NaCl、2.422g Tris、3.632g EDTA溶于200ml去离子水调节PH值至8.0，常温保存备用；苯酚/氯仿/异戊醇混合液：苯酚/氯仿/异戊醇三种试剂按照25/24/1的体积比例混合常温备用；氯仿/异戊醇混合液：氯仿/异戊醇两种试剂按照24/1的体积比例混合常温备用；B)DNA提取：1)、液氮研磨干燥的真菌样本，将研磨成粉末状的真菌样本收集到1.5ml EP管中，加入500ml STE缓冲液、30μl蛋白酶K、30μl 10％SDS，于54℃消化6‑8h；所用真菌样本量不少于75mg；2)、加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇混合液，振荡至出现絮状物，10000r/min离心4min；3)、取上清至另一1.5ml EP管中，加入500μl氯仿/异戊醇混合液，振荡混匀后10000r/min离心4min；4)、取3)上清至新1.5ml EP管中，加入5mol/L NaCl溶液30μl、800μl无水乙醇，混匀后于‑20℃放置6‑10h，10000r/min离心4min；5)、保留4)沉淀加入70％的乙醇600μl，混匀后10000r/min离心4min；6)、弃5)上清后，将沉淀中的乙醇充分挥发干净后得到目的物，加入50μl‑100μl的无菌水溶解4℃保存。