建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法

摘要

本发明公开了一种建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，本发明针对目的基因PNRSV的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温65℃左右，几十分钟即可实现核酸的高效扩增；4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；LAMP不需要模板的热变性，长时间温度循环，在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的浪费，使反应速度可提高30-50％；根据反应管中有无肉眼可见的焦磷酸镁白色沉淀，作为判断核酸是否扩增的简单方法；提供的方法对PNRSV的检测特异性强，具有快速、高效、仪器要求简易，操作简便，成本低，易于在基层推广使用的特点。

主权项

一种建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，其特征在于，具体检测方法步骤如下：(1)设计用于检测李属坏死环斑病毒的的LAMP引物：根据现有技术报道及GenBank中公布的PNRSV分离物的CP基因序列的CP基因保守序列，利用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4设计1套特异性引物，包括1对外引物和1对内引物，引物序列如下(5′‑3′)：F3：AATCATACCCACGCTGGTGB3：AATTCGGGGAGGCACATTCFIP：TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC‑TTGCAAGAAGTGCCATCCGBIP：TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA‑TCACGGTCCAAGTGGTCT；(2)植物总RNA的提取：取0.1g新鲜植物叶片或幼嫩枝条在液氮中研磨至粉末，采用RNAplant plus Reagen试剂盒提取样品总RNA，通过抽提RNA产物加入DEPC‑ddH2O溶解，‑70℃保存备用；(3)逆转录：以提取的植物总RNA为模板，建立反转录体系，反转录合成cDNA序列，20μL的反转录体系；(4)配制LAMP反应体系：反应体系为27uL，各组分的用量为：10×Buffer缓冲液2.5uL；(5)通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增；(6)通过上述步骤扩增结束后肉眼观察反应管浊度的变化，进行LAMP扩增产物的检测。