一种重组酵母菌及其制备方法

摘要

本发明公开了一种重组酵母菌及其制备方法。该方法包括如下步骤：(1)将表达载体I转入宿主酵母菌中，得到转入所述表达载体I的重组酵母菌，记作酵母菌A；(2)将表达载体II转入所述酵母菌A中，得到转入所述表达载体I和所述表达载体II的重组酵母菌；将所述转入所述表达载体I和所述表达载体II的重组酵母菌记作酵母菌B。实验证明，用本发明方法制备得到的重组酵母菌中不携带任何抗性基因；转入的表达载体拷贝数多，可达5-50个拷贝，且均整合到宿主菌的基因组中；用本发明的重组菌表达的外源基因产品成为安全的食品级产品。本发明制备方法操作简单、省时省力、成本低廉。因此，本发明的重组酵母菌及其制备方法适于推广使用。

主权项

一种制备重组酵母菌的方法，包括如下步骤：(1)将表达载体I转入宿主酵母菌中，得到转入所述表达载体I的重组酵母菌，记作酵母菌A；(2)将表达载体II转入所述酵母菌A中，得到转入所述表达载体I和所述表达载体II的重组酵母菌；将所述转入所述表达载体I和所述表达载体II的重组酵母菌记作酵母菌B；(3)诱导所述酵母菌B中的所述表达载体II中的Cre重组酶表达，所述Cre重组酶将所述酵母菌B中的所述载体I中的抗性基因切除，抗性筛选，得到含有所述外源基因和所述表达载体II、但不含有所述表达载体I中的抗性基因的重组酵母菌；将所述含有所述外源基因和所述表达载体II、但不含有所述表达载体I中的抗性基因的重组酵母菌记作酵母菌C；(4)传代培养所述酵母菌C，至所述酵母菌C中的所述表达载体II丢失，抗性筛选，得到含有所述外源基因但不含有所述表达载体I中抗性基因也不含有所述表达载体II的重组酵母菌，即为目的重组酵母菌；所述表达载体I为由如下元件顺次连接组成的环状载体：loxP位点序列I、宿主酵母菌的18S rDNA序列、外源基因表达盒、loxP位点序列II、抗性筛选标记基因表达盒和原核复制起点序列；所述外源基因表达盒由组成型3‑磷酸甘油醛启动子、外源基因、蛋白纯化标签编码基因和AOX1终止子组成，所述抗性筛选标记基因表达盒由TEF1p启动子、EM7p启动子、新霉素抗性基因、CYC1终止子组成，所述原核复制起点序列为PUC‑Ori；所述表达载体I的外源基因表达盒中，所述蛋白纯化标签为myc标签和/或组氨酸标签；所述表达载体II是将所述宿主酵母菌的自我复制序列插入载体pSH65的BglII位点得到的；所述载体pSH65中含有Cre重组酶表达盒；所述表达载体I中，所述宿主酵母菌的18S rDNA序列如序列表中序列2所示，所述loxP位点序列I和所述loxP位点序列II均如序列表中序列4所示，所述表达载体II中，所述宿主酵母菌的自我复制序列如序列表中序列3所示。