人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用

摘要

人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用，涉及一种抗体。提供一种人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用。为兔的血清免疫球蛋白Ig G，由重链55kDa和轻链30kDa两条链组成。先表达和纯化K5多肽；再制备人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体。用于人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可以特异性与K5蛋白结合；人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可以检测标本中转染表达K5蛋白质粒的人肺腺癌细胞的K5表达分布；人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可以检测标本中转染表达K5蛋白质粒的人肺腺癌细胞的K5表达分布。

主权项

人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)表达和纯化K5多肽，其具体方法如下：将含有K5部分序列的cDNA的质粒pPIC9K‑K5，经测序鉴定正确后，利用限制性内切酶Sal I线性化，通过电转化至毕赤酵母GS115中，通过PCR方法鉴定阳性重组子，挑取的阳性重组子经甲醇诱导表达挑选高拷贝阳性菌，进行诱导表达，收集部分酵母上清，经三氯乙酸沉淀法浓缩蛋白后，Tricine SDS‑PAGE电泳检测，用硫酸铵盐沉淀法纯化浓缩蛋白、透析后，阴离子交换层析过柱，用洗脱液上柱，流出液即为纯化的K5蛋白；2)制备人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体，其具体方法如下：用纯化的15kDa的K5蛋白与弗氏佐剂混合，免疫动物，经纯化获得人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体；所述用纯化的15kDa的K5蛋白与弗氏佐剂混合，免疫动物，经纯化的具体方法如下：第一次用纯化的K5蛋白1mg加弗氏完全佐剂，剧烈震荡，充分乳化后免疫新西兰兔，每隔14天用纯化的K5蛋白0.5mg加不完全弗氏佐剂，与生理盐水乳化，加强免疫两次，用颈动脉取血法接取兔血清，用ELISA法检测多克隆抗体的效价，抗体效价分析表明抗体效价达到1∶1000，将血清总蛋白经过50％硫酸胺沉淀后，结合于protein A柱上，用亲和层析法分离出多克隆抗体。