采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法

摘要

本发明涉及采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，包括生产用原料获取，原料粉碎、提取蛋白，分级盐析、酶原沉淀，粗品酶解，亲和层析分离纯化，超滤浓缩除菌，真空冷冻干燥得到成品。与现有技术相比，本发明体现出了亲和层析法生产胰蛋白酶的优越性，有利于工艺的简化和质量的可控，降低了生产成本，提高了产品品质，以较高的收率得到纯度很高的产品(＞3000单位/毫克)，大大提高了产品的市场竞争力。

主权项

采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)获取生产用原料：将新鲜的牛胰或猪胰进行冷冻保存，得到冷冻原料；(2)原料粉碎、提取蛋白：用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，控制温度为4℃搅拌提取3‑5h，放置过夜，次日将提取液进行固液分离，在清液中加入硫酸铵至30％饱和度，并加入硅藻土助滤，控制温度为4℃放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；(3)分级盐析、酶原沉淀：在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，用1.5倍重量的冰水溶解沉淀，加入0.5倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5，在25℃下保温静置48h，过滤收集滤液，再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到胰蛋白酶粗品；(4)粗品酶解：胰蛋白酶粗品用10倍体积的去离子水溶解，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高纯胰蛋白酶，控制温度为4℃酶解48h，酶解后的溶液离心得到酶解液；(5)亲和层析分离纯化：将亲和层析介质装柱，用0.1M Tris‑Hcl，pH8.0缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，然后用0.1mol/L甲酸‑0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰；(6)超滤浓缩除菌：采用超滤膜对收集的洗脱峰进行浓缩，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；(7)真空冷冻干燥得到成品：采用真空冷冻干燥技术，将过滤除菌后得到的酶液直接冷冻干燥，即得到高纯度胰蛋白酶成品。