猪肉及其制品中弓形虫RT-LAMP快速检测方法

摘要

本发明公布了一种猪肉及其制品中弓形虫RT-LAMP快速检测方法。现有技术中检测时间长且繁琐，工作量大，很难适应现代化食品安全快速检测的需要。本发明取样加入Trizol试剂，离心取上清液加入200µl氯仿，充分混合离心后取上清液，加入与该上清液等体积的异丙醇，离心后加入1ml体积含量为75%的乙醇，离心后干燥沉淀物，加入20µlRNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；将RT-LAMP扩增反应体灭活BstDNA聚合酶，得到扩增产物；加入1μL的SYBRGreenⅠ染料，或于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果。本发明具有较高的特异性和灵敏度，且避免假阳性的出现。

主权项

猪肉及其制品中弓形虫RT‑LAMP快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1).样品前处理猪肉及其制品取样25g，加入10倍猪肉及其制品体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；步骤(2).弓形虫RNA提取取组织匀浆样品转移到离心管后，加入Trizol试剂，其中组织匀浆样品与Trizol试剂的体积含量比为1:10，常温静置5min；在转速12000rpm，温度为4 ℃条件下离心5 min，取上清液至新的离心管中，加入200 µl氯仿，盖上离心管盖，充分混合至溶液呈乳白状后，常温静置5min；在转速12000rpm，温度为4 ℃条件下离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入与该上清液等体积的异丙醇，充分混合后，常温静置10 min；在转速12000rpm，温度为4 ℃条件下离心10 min，弃掉上清液，加入1 ml 体积含量为75%的乙醇洗涤离心管壁，在转速12000 rpm，温度为4 ℃条件下离心10 min后，取沉淀物；常温下干燥沉淀物5min，加入20 µl RNase‑free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；将RNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；步骤(3).RT‑LAMP扩增将RT‑LAMP扩增反应体系振荡混匀后，置于65℃水浴锅中反应1 h后，置于80℃水浴锅中2 min灭活Bst DNA聚合酶，得到扩增产物；所述的RT‑LAMP扩增反应体系为25 μl由2μl的25 mmol/L MgCl2，6.0 μl 的2.5 mmol/L dNTPs，0.5μl的RNA酶抑制剂，2.5 μl的10×Bst DNA Buffer，0.5 μl的10 mmol/L F3引物，0.5 μl的10 mmol/L B3引物，2.5μl的10 mmol/L FIP引物，2.5μl的10 mmol/L BIP引物，1.0μl的10 mmol/L LF引物，1.0μl的10 mmol/L LB引物，2.0 μl的5 mol/L甜菜碱，1.0μl的反转录酶，1.0μl的Bst DNA聚合酶，2.0μl的RNA提取物组成；步骤(4).扩增产物电泳检测：反应结束后，在扩增产物中直接加入1μL的SYBR GreenⅠ染料，混匀后置于桌面上拍照并肉眼观察结果；颜色变为绿色为阳性，说明有弓形虫感染，橙色则为阴性，说明无弓形虫感染；或取扩增产物2～3 μL，于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察结果,有梯形条带为阳性，说明有弓形虫感染，无条带则为阴性，说明无弓形虫感染。