低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法

摘要

本发明涉及一种低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法。首先获得了具有高通透性细胞壁的活体小球藻，利用低电压及瞬时电脉冲的条件，将基因载体及外源基因导入活体小球藻，避免了转化藻体时高强度电压或长时间电脉冲对小球藻的损伤，从而使外源基因平稳地进入小球藻细胞，建立小球藻生物反应器。本发明利用较温和的低电压瞬时电脉冲电击转化法成功地构建了小球藻生物反应器，条件温和，低成本，便捷的使外源基因安全地进入小球藻细胞的新方法，对于生产高附加值产品，特别是来源紧俏的基因工程产品具有广泛应用前景。

主权项

一种低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法，其特征在于包括以下步骤：1)取处于对数生长期的小球藻，以5％的接种量接种于Knop液体培养基中，25℃下静置培养，光照条件3000～4000lx，每4h摇动一次，连续照明，培养2d；取上述培养液，离心收集小球藻细胞，重悬于MBBM培养基中，置于光照培养箱中培养，3000～4000lx，25℃下静置培养24h；将培养后的小球藻细胞，加入含有4％(W/V)纤维素酶的高渗PBS缓冲液，该缓冲液为pH 6.0的0.025mol/L磷酸缓冲液，由0.2mol/LNaH2PO4·2H2O和0.2mol/LNa2HPO4·2H2O配置而成，并含有0.3mol/L山梨醇/甘露醇，重悬细胞，30℃下，80r/min摇床，黑暗酶解4h，进行处理；2)取步骤1)处理后的小球藻液，8000rpm离心5min，用Hepes Buffer重悬细胞沉淀，加入携带ble基因的质粒pSP124S DNA，浓度为76.5ng/μl；电击转化小球藻，脉冲电压为500V，脉冲持续时间1.2ms；ble基因载体pSP124S质粒的构建：设计引物p1为GTATCGATGGCCAAGcTGACCAGcGCCG；设计引物p2为TTGGTCGaCGTCGGTtAGTCC；以质粒pUT430 DNA为模板，以PCR的方法扩增ble基因，PCR的条件是：95℃变性5min；95℃，40sec，56℃，40sec，72℃，40sec，30个循环；72℃延伸10min；获得395bp的PCR产物；用内切酶Msc I和Sal I分别酶切处理PCR产物和pSP105 DNA，以DNA连接酶将ble基因重组到pSP105 DNA上；并利用内切酶BamH I和Nco I在相对于转录起始‑173的位置到翻译起始，插入一个RBCS2启动子；以内切酶SacI和KpnI双酶切处理以上构建产物获得含有ble基因的1.2kb大小的DNA片段；同时以内切酶SacI和KpnI双酶切处理pBluescript SK(Stratagene)质粒DNA；利用DNA连接酶将ble基因重组到质粒pBluescript SK(Stratagene)上，重组质粒命名为pSP124S，含Zeocin抗性基因ble；3)将藻体于冰上预冷6min，加入到含0.5mol/L蔗糖的Knop液体培养基中，25℃下，光照条件3000～4000lx温和培养24h，然后加至含有0.5mol/L蔗糖，4μg/mL Zeocin的Knop半固体培养基中，混合均匀，涂布于含有0.5mol/L蔗糖，10μg/mL Zeocin的Knop固体培养基上，置于25℃培养箱中，光照条件3000～4000lx静置培养10d。