发明名称 |
一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库及其构建方法 |
摘要 |
本发明提供了一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库及其构建方法,属于抗体库及其制备领域;本发明为取多药耐药性大肠癌病理组织,注射BALB/C成年小鼠,检测抗体滴度大于1:512时,处死小鼠取脾组织,提取脾组织总RNA并逆转录为cDNA;以此为模板,设计17条重链上游引物和5条重链下游引物;20条轻链上游引物及2条轻链下游引物,PCR扩增出重链Fd段及轻链κ和λ链,依次克隆入pComb3载体并转化至E.coliXL1-Blue中,成功构建库容为2.47×106CFU的抗P-gpFab免疫抗体,重链Fd段平均插入率为80%,轻链平均插入率为90%,Fab插入率为72%。 |
申请公布号 |
CN102888658A |
申请公布日期 |
2013.01.23 |
申请号 |
CN201210352439.1 |
申请日期 |
2012.09.21 |
申请人 |
大连大学 |
发明人 |
张学梅;梁文波;曹阳;张海玉;王清 |
分类号 |
C40B40/10(2006.01)I;C12N15/13(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C07K16/30(2006.01)I |
主分类号 |
C40B40/10(2006.01)I |
代理机构 |
大连智慧专利事务所 21215 |
代理人 |
周志舰 |
主权项 |
一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库,其特征在于:(1)取多药耐药性大肠癌病理组织,匀浆后免疫小鼠,抗体滴度大于1:512,提取总RNA并逆转录为cDNA;(2)设计17条重链上游引物,见SEQ ID NO:1‑17和5条重链下游引物,见SEQ ID NO:18‑22及20条轻链上游引物,见SEQ ID NO:,23‑42及2条轻链下游引物见SEQ ID NO:43,44,其中重链5′引物引入XhoⅠ酶切位点,3′引物引入SpeⅠ酶切位点,轻链5′引物引入SacⅠ酶切位点,3′引物引入XbaⅠ酶切位点;(3)PCR扩增小鼠IgG重链及轻链基因片段;(4)重链Fd库的建立:将载体pComb3质粒与重链Fd段扩增产物分别进行XhoⅠ、SpeⅠ双酶切后连接,连接产物热激转化XL1‑blue感受态细胞,得重链Fd库,多次转化后使Fd库的克隆数达到105以上,并提取重链Fd‑pComb3库质粒;(5)轻链T‑L库的建立:将轻链扩增产物与T载体连接,将连接产物热激转化TOP10感受态细胞,得到轻链T‑L库,多次转化后使T‑L克隆数达到105以上,并提取轻链T‑L库质粒;(6)抗体库的建立:将重链Fd‑pComb3库质粒与轻链T‑L库质粒分别进行XbaⅠ、SacⅠ双酶切,凝胶回收,将Fd‑pComb3与L连接,连接产物热激转化至XL1‑blue感受态细胞,多次转化后得到Fab抗体库, Fab抗体库容量达到106克隆以上。 |
地址 |
116622 辽宁省大连市经济技术开发区 |