主权项 |
一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法,其特征在于其具体步骤是:1)DNA提取:将种子置于营养钵中发芽出苗至幼苗有2‑3片真叶时,取4cm左右的叶片于研钵中,加入1.5×CTAB提取缓冲液将其研碎,转入离心管65℃水浴半小时;加入与提取缓冲液等体积的氯仿/异戊醇混合液,手摇10分钟,10000rpm离心10分钟;取其上清,加入冰冻95%乙醇,‑20℃冰柜内放置30分钟沉淀DNA;10000rpm离心10分钟,弃上清,加75%乙醇,静置4分钟去盐;弃乙醇,离心管倒置于吸水纸上风干;加200ul灭菌双蒸水溶解DNA待用;所述1.5×CTAB提取缓冲液由1.5%(w/v)的十六烷基三甲溴化铵,1.4M的氯化钠,100mM的 Tris‑Cl缓冲液,20mM 的乙二胺四乙酸,0.2%(v/v)的α‑巯基乙醇构成;2)PCR反应:在PCR管中分别加入DNA模板、10×PCR含氯化镁缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷、引物P1和P2、Taq酶及双蒸水;先94℃预变性4分钟;再94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸1分钟,32个循环;72℃延伸7分钟,95℃水浴4分钟变性后置冰上;所述引物P1序列为5’‑CGGTCAGATTCCAACAGA‑3’,引物P2序列为5’‑GCCATCTCAGAGAGGACA‑3’3)注胶电泳检测:将分离胶缓慢注入两玻璃板之间,静置凝固半小时以上;将玻璃板装上电泳槽,2000V,90W预热半小时;插梳子,点样;2000V,85W电泳约3小时;下胶后,将胶板放在10%冰醋酸的盒子里,轻摇20分钟至胶全部脱色;用清水漂洗两次,每次5分钟;放入染色盆染色液中,轻轻摇动染色15‑20分钟;取出胶板,用清水漂洗10秒;放入显影液中显影至DNA带清晰;水洗1分钟;4)受检种子纯度计算:用上述方法分别获取国丰棉198杂交一代和亲本种子电泳谱带,计数受检样品中有清晰的两条带型的种子数,并用下式计算受检样品的种子纯度(%)=受检样品中有清晰的两条带型的种子数/受检种子总数×100。 |