具有抗肿瘤细胞增殖活性的毛头鬼伞漆酶及其制备方法

摘要

本发明公开了一种具有抗肿瘤细胞增殖活性的毛头鬼伞(Coprinus comatus)漆酶及其制备方法。本发明所提供的毛头鬼伞漆酶，按照包括以下步骤的方法制备：1)破碎细胞；2)收集蛋白粗提物；3)从步骤2)中收集的蛋白粗提物中分离纯化漆酶，得到的漆酶即为毛头鬼伞提取物，所述漆酶的分子量为64KD且N末端序列见序列表序列1。依据本发明的制备方法所获得的毛头鬼伞提取物对癌症细胞增殖和HIV反转录酶活性都有明显的抑制作用，在癌症药物和抗艾滋病新药研究领域中具有重要价值。

主权项

毛头鬼伞（Coprinus comatus）提取物的制备方法，包括以下步骤：1）破碎细胞；2）收集蛋白粗提物；3）从步骤2）收集的蛋白粗提物中分离纯化漆酶，得到的漆酶即为毛头鬼伞提取物，所述漆酶的分子量为64KD且N末端序列见序列表中序列1；所述从步骤2）收集的蛋白粗提物中分离纯化漆酶包括如下步骤：a）将从步骤2）收集的蛋白粗提物进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序包括如下三步洗脱：第一步洗脱用pH6.8‑7.5的磷酸缓冲溶液A洗脱；第二步洗脱用pH6.8‑7.5的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；第三步洗脱用pH6.8‑7.5的如下溶液洗脱：溶质是0.2M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；所述磷酸缓冲溶液A的溶质为3.5‑4.5mM NaH2PO4和5.5‑6.5mM Na2HPO4，溶剂为水；b）将从步骤a）获得的洗脱峰进行阳离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是CM，所采用的洗脱程序包括如下三步洗脱：第一步洗脱用pH6.1‑6.8的磷酸缓冲溶液B洗脱；第二步洗脱用pH6.1‑6.8的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；第三步洗脱用pH6.1‑6.8的如下溶液洗脱：溶质是0.15M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；所述磷酸缓冲溶液B的溶质为5.75‑6.75mM NaH2PO4和3.2‑4.2mM Na2HPO4，溶剂为水；c）将从步骤b）获得的洗脱峰进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是Q；所采用的洗脱程序为进行NaCl线性洗脱，所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为3.5‑4.5，溶质为NaCl，溶剂为醋酸缓冲溶液；所述线性洗脱的时间是200分钟，所述线性洗脱中NaCl的浓度在200分钟内由0M线性升至0.15M；所述醋酸缓冲溶液的溶质为7.7‑8.7mM醋酸和1.3‑2.3mM醋酸钠，溶剂为水；d）将从步骤c）获得的洗脱峰进行凝胶过滤层析，得到具有漆酶活性的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括64KD，所用的层析柱的柱长度和柱内径比为25:1～50:1。