一种检测重组人白细胞介素-12蛋白活性的方法

摘要

本发明公开了一种检测重组人白细胞介素-12蛋白活性的方法。该方法包括如下步骤：1)用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素，检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生的γ干扰素的量，得到标准曲线；2)用于1)相同的方法用待测重组人白细胞介素-12蛋白进行试验，得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白的浓度值；3)计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白的活性。本发明方法操作简便、快速、稳定且成本低廉、具有很高的稳定性、重复性、灵敏度及特异性。因此，本发明方法在rhIL-12蛋白活性检测领域将有广阔的应用前景，为rhIL-12蛋白的临床应用、药性检测等提供了良好的基础。

主权项

1.一种检测重组人白细胞介素-12蛋白的活性的方法，包括如下步骤：1)用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素，检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生的γ干扰素的量，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12蛋白标准品的浓度为横坐标，作曲线图，得到S型标准曲线图，从所述S型标准曲线图中得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12蛋白标准品的浓度值，将该浓度值记作ED_50s；2)用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素，检测每种浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生的γ干扰素的量，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素-12蛋白的浓度为横坐标，作曲线图，得到S型曲线图，从所述S型曲线图中得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白的浓度值，将该浓度值记作ED_50r；3)根据公式I，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白的活性，(公式I)其中，Ps为重组人白细胞介素-12蛋白标准品的活性值，Pr为待测重组人白细胞介素-12蛋白的活性值；所述步骤1)中所用的人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901与所述步骤2)中所用的人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901的状态相同，所述步骤1)的刺激NKG细胞产生γ干扰素的方法与所述步骤2)中的刺激NKG细胞产生γ干扰素的方法相同，所述步骤1)的检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激NKG细胞产生的γ干扰素的量的方法与所述步骤2)中的检测每种浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激NKG细胞产生的γ干扰素的量的方法相同；所述步骤1)和所述步骤2)没有先后顺序；所述步骤1)中，所述用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素的方法包括如下步骤：将所述不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品分别与所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901共培养，得到所述γ干扰素；所述步骤2)中，所述用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然 杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素的方法包括如下步骤：将所述不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白分别与所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901共培养，得到所述γ干扰素；所述步骤1)的共培养中，所述共培养的体系由所述重组人白细胞介素-12蛋白标准品、所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901和培养基组成；所述步骤2)的共培养中，所述共培养的体系由所述待测重组人白细胞介素-12蛋白、所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901和培养基组成；所述方法中，在所述步骤1)和所述步骤2)前，包括如下细胞活化步骤：将人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901接种于细胞培养基I中，在温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5％的条件下培养至对数生长期，取对数生长期的细胞；所述细胞培养基I由α-MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白细胞介素-2组成，α-MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白细胞介素-2的配比为：8ml α-MEM培养基∶1ml胎牛血清∶1ml马血清∶1000IU重组人白细胞介素-2；所述共培养中培养基由1640培养基和胎牛血清组成，1640培养基与胎牛血清的体积比为9∶1；所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901在所述共培养体系中的浓度为2.5×10⁵个/ml；所述共培养的温度为37℃，所述共培养的二氧化碳体积浓度为5％，所述共培养的时间为18-24小时；所述步骤1)中重组人白细胞介素-12蛋白标准品在所述共培养体系中的浓度分别为6.4ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml、0.8ng/ml、0.4ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml；所述步骤2)中待测重组人白细胞介素-12蛋白在所述共培养体系中的浓度分别为6.4ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml、0.8ng/ml、0.4ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml。