一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒的RT-PCR法

摘要

本发明涉及一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒（Duck hemorrhagic ovaritis virus,DHOV）的RT-PCR法。作为一种非常具有特异性、敏感性及重复性的畜禽疫病快速检测技术，RT-PCR方法已广泛应用于多种黄病毒属特异性诊断，但通常检测的靶基因主要是NS5。本发明是在现已公开发表的51个具有代表性的黄病毒株的E基因序列比较基础上，设计了通用性的针对黄病毒E基因核酸序列的特异性引物对，建立了RT-PCR方法。该方法具有较好的特异性,能最低检测到20pg黄病毒,也具有极好的重复性。本发明建立的DHOV RT-PCR检测方法为该病的快速检测提供了一种可靠方法，这对于本病的实验室检测、诊断、流行病学调查及病原遗传演化研究提供了较好的方法基础，具有重要意义。

主权项

一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒的RT‑PCR法，其特征在于该方法为：（1）用常规病毒核酸提取方法提取疑似鸭出血性卵巢炎病例的肝脏、卵巢组织样品中的可能含有的DHOV总RNA；（2）RT（反转录）反应20μL体系，各组分包括DHOV总RNA 3μL、AFVTR1μL、5×反转录Buffer 4μL、含Mg2+的dNTP 4μL、RNA酶抑制剂0.5μL、反转录酶0.5μL，最后用灭菌双蒸水或灭菌DEPC水补足反应体积至20μL，瞬时离心后室温平衡5~10min，在42℃保温1.5h，即可获得用于PCR扩增的cDNA；（3）PCR（聚合酶链式扩增）扩增反应25μL体系，各组分包括10×PCR Buffer2.5μL、含Mg2+的dNTP 2μL、引物AFVTF和AFVTR各0.5μL、rTaq酶0.5μL、cDNA 3μL、加灭菌双蒸水至25μL。反应程序为95℃变性5min，32×（94℃45s、55℃45s，72℃50s）个循环反应，最后72℃延伸10min；其中AFVTF和AFVTR是针对黄病毒基因组E基因设计的一对引物，这对引物的序列为AFVTF：5'‑TTACCATGGACAGGGTCATCA‑3'AFVTR：5'‑TCCAATTGTGCTCCCACTTCT‑3′；（4）电泳检测  PCR反应结束后，取5~10μL扩增产物用1%的琼脂糖凝胶，在100V、45~60min条件下进行电泳，进行观察、照相和记录结果。