一种双链RNA的制备方法

摘要

本发明公开了一种双链RNA的制备方法。现有体外制备siRNA的方法价格高，定制周期长，实验规模受限制。本发明方法首先利用PCR扩增的方法克隆目的基因分子；利用pET-T7质粒构建含有目的基因片段的表达载体；将含有基因片段插入的pET-T7表达载体转化到表达型菌株E.coliHT115中，选取含有目的载体的阳性菌落；接种于LB液体培养基中，加入IPTG诱导培养；抽提总RNA，溶解于RNaseA缓冲液变性，冷却复性，加入RNaseA酶切，去除单链RNA，纯化双链RNA，溶解沉淀，所得溶液即为纯化后的双链RNA样品。本发明制备方法简单，实施步骤快捷，操作重复性强，样品合成量不受限制。

主权项

一种双链RNA的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1).基因克隆：利用PCR扩增的方法克隆目的基因分子；根据目的基因分子的cDNA序列设计带有酶切位点的正向引物和反向引物；以目的基因分子的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，克隆目的基因分子，得到PCR产物；PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析；采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后的PCR产物；步骤(2).载体构建：利用pET‑T7质粒构建含有目的基因片段的表达载体；纯化后的PCR产物和pET‑T7质粒分别用限制性内切酶进行双酶切，得到目的基因的酶切产物和pET‑T7质粒的酶切产物；目的基因的酶切产物和pET‑T7质粒的酶切产物用凝胶回收试剂盒纯化，得到纯化后目的基因的酶切产物和纯化后pET‑T7质粒的酶切产物；利用DNA连接试剂盒连接纯化后目的基因的酶切产物和纯化后pET‑T7质粒的酶切产物；将连接后的产物转入感受态细胞E. coli DH5α中，涂板，30～37oC培养12～24小时；挑选阳性单菌落进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析；选取含有目的基因片段的阳性单菌落，测序分析插入基因片段序列的正确性，得到含有正确基因片段插入的单菌落；步骤(3).载体转化： 挑取经鉴定含有正确基因片段插入的单菌落，接种于LB液体培养基中，30～37oC条件下培养12～24小时，离心得到沉淀；利用小量质粒抽提试剂盒抽提沉淀菌体中的pET‑T7表达载体，凝胶电泳检测抽提产物；将含有基因片段插入的pET‑T7表达载体转化到表达型菌株E.coli HT115中，涂板培养，挑选阳性菌落进行PCR检测，凝胶电泳分析，选取含有目的载体的阳性菌落，保存待用；此处的含有目的载体的阳性菌落为携带pET‑T7载体的E.coli HT115单菌落；步骤(4).双链RNA的诱导表达：将携带pET‑T7载体的E.coli HT115单菌落接种于LB液体培养基中，30～37oC条件下培养12～24小时；以1:20～1:50的比例扩大培养至OD600=0.4～1.0；在LB液体培养基中加入异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液体培养基中的终浓度为0.2～1.0mmol/L，30～37oC诱导培养2～8小时；离心收集细菌沉淀，磷酸缓冲液漂洗，得到漂洗后的细菌沉淀，保存待用；步骤(5).双链RNA的纯化：总RNA抽提：取漂洗后的细菌沉淀，利用Trizol试剂盒提取漂洗后的细菌沉淀中的总RNA；变性：将提取的总RNA溶解于核糖核酸酶A缓冲液中，80～90oC变性5～15分钟，得到变性溶液；复性：将变性溶液置于水浴中冷却至常温，使得变性溶液复性，得到复性后的溶液；酶切：在复性后的溶液中加入核糖核酸酶A进行酶切，加至核糖核酸酶A在复性后的溶液中的终浓度为10～50μg/ml，在35～37oC条件下反应10～60分钟，去除单链RNA，得到酶切后产物，电泳检测酶切效果；纯化：在酶切后产物中加入与酶切产物等量体积的酚氯仿溶液，充分混匀，离心取上清液；在上清液中加入2～3倍上清液体积的无水乙醇，充分混匀，静置，沉淀双链RNA，离心收集沉淀物；用70～75﹪乙醇充分洗涤，离心收集沉淀，自然干燥；溶解：加入灭菌水溶解沉淀，所得溶液即为纯化后的双链RNA样品；凝胶电泳检测双链RNA样品，分光广度计法测定核酸样品浓度，‑30～‑20oC保存待用。