泛醌类代谢中间产物的发酵生产方法

摘要

一种基因工程技术领域的利用含有条件性重组酶的基因工程菌株发酵生产泛醌类代谢中间产物的方法。包括如下步骤：步骤一，构建和培养基因工程菌株；步骤二，加入L-阿拉伯糖于步骤一中的培养物中，诱导培养；步骤三，收集步骤三的培养物，处理后进行HPLC检测，获得泛醌类代谢中间产物。利用本发明的基因工程菌株发酵生产泛醌类代谢中间产物的方法，可实现对必需途径中的具有复杂结构的泛醌类代谢中间产物进行生物发酵生产，操作步骤简便，成本低廉，无有特殊的仪器要求，产量可达mg/L。

主权项

一种发酵生产泛醌类代谢中间产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，利用同源重组技术，构建在目标必需基因两侧带有条件性重组酶识别位点和正负筛选标记、包含条件性重组酶质粒的基因工程菌株DYUBI，该菌株为包含质粒pBFLP的ubiX基因缺失的大肠杆菌工程菌株，且菌株中的ubiD基因两侧带有正副筛选标记基因sacB和tet以及两个FRT位点；步骤二，培养上述基因工程菌株DYUBI；步骤三，加入终浓度为0.2％的L‑阿拉伯糖于步骤二的培养物中，在32℃下进行0.2％L‑阿拉伯糖振荡摇床培养3小时；步骤四，收集步骤三的培养物，处理后进行反向HPLC检测，获得目标泛醌合成途径的中间产物——3‑八异戊二烯‑4‑羟苯甲酸；所述的收集是指：以大肠杆菌DY329和基因工程菌株DYUBI为发酵菌种，发酵条件为：发酵培养基为每升水中含磷酸氢二钾7.0g，磷酸二氢钾3.0g，三水合柠檬酸钠0.5g，七水合硫酸镁0.1g，硫酸铵1.0g，葡萄糖2.0g，pH 7.0，在32℃培养大肠杆菌DY329和基因工程菌株DYUBI至OD600＝1.0，加入终浓度为0.2％的L‑阿拉伯糖，继续摇培三小时后，室温12,000rpm离心收集细胞；所述的处理是指：取收集所获得培养物沉淀，加入100mL水重悬沉淀；之后加入1000mL的3∶2比例的甲醇/石油醚混合液，漩涡震荡一分钟后，加入终浓度为5pmol的辅酶Q10标品，4℃避光摇培过夜；次日将上层溶液吸出备用，再补加400mL石油醚，4℃避光摇培一小时后，再次吸出上层溶液，与之前的上层溶液混合，用氮气吹干后溶于20mL的9∶1比例的甲醇/乙醇混合液。