交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用

摘要

本发明是涉及对核酸序列新的扩增技术，更具体地说，涉及利用交叉引物恒温扩增靶核酸序列的方法。本发明还涉及了在扩增反应中标记扩增靶核酸序列的方法及靶核酸序列的快速检测方法。本发明还涉及了在快速核酸诊断方面的试剂盒及其在细菌和病毒等病原微生物的核酸检测方面的应用，以及在人类遗传性疾病相关的基因诊断应用。

主权项

一种用于非诊断目的交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其特征为包括以下步骤：1)设计一对交叉扩增引物和一对剥离引物，其包括：a)设计一对交叉扩增引物，交叉扩增引物F和交叉扩增引物R，交叉扩增引物F和交叉扩增引物R由杂交序列、连接区域和互换序列三部分组成；其中，杂交序列是与模板特异性杂交用于扩增延伸的碱基序列；连接区域用于引物上两个不同序列的连接，为一至三个单核苷酸；互换序列，即交叉扩增引物F的杂交序列用来作为交叉扩增引物R的5’末端序列，反之，交叉扩增引物R的杂交序列用来作为交叉扩增引物F的5’末端序列；和b)设计一对剥离引物，剥离引物F和剥离引物R，剥离引物F为正向外引物，与靶基因的反义链完全互补，剥离引物R为反向外引物，与靶基因的正义链完全互补；2)在扩增靶核酸序列的两端引入交叉引物杂交位点和产生固定末端，为快速扩增准备模板，其包括：a)使交叉扩增引物F与核酸靶分子杂交，其中所述交叉扩增引物F的5’末端带有交叉扩增引物R的杂交序列；b)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸交叉扩增引物F，合成双链核酸；c)使正向剥离引物F与核酸靶分子杂交；d)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸剥离引物F，剥离交叉扩增引物F的延伸链，由此产生固定的正向链5’末端；e)使用被剥离的扩增引物延伸链作为模板，与交叉扩增引物R杂交，其中所述交叉扩增引物R的5’末端带有交叉扩增引物F的杂交识别序列；f)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸交叉扩增引物R，合成双链核酸；g)使反向剥离引物R与核酸靶分子杂交；h)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸剥离引物R，剥离交叉扩增引物R的延伸链，由此产生固定的反向链5’末端，此时产生的交叉扩增引物R延伸链两端已经固定，并在3’和5’末端分别引入交叉扩增引物F和R的杂交序列，用作快速扩增的模板；和3)以线性结构和/或二级结构的方式进行扩增，通过引物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一条模板上可有多个扩增反应同时进行，位于后方的引物延伸依次剥离前方引物的延伸链，而被剥离的延伸链又可作为模板参与下一轮的扩增，从而大大地提高了扩增速度。