紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法

摘要

本发明公开了紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法，方法通过用吸附无细胞百白破疫苗替代成本高且不容易获得的标记抗原用于敏化红细胞，用GE公司Ultrospec6300pro紫外/可见光分光光度计于样品检测，及仪器自带软件做数据处理，本发明实验证明：三次检测结果自身标准偏差范围0.06～15.92%，方差范围：0.00～1.69%。紫外分光光度计结果和新发明三次检测平均值结果比较：数据均差：-1.37%；数据差值标准偏差：-1.28%；数据差值方差：0.02%，本发明的检测结果在合理的理论范围内，确是一种廉价且微量检测血液制品人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法。

主权项

紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法，其特征包括：敏化红细胞的抗原选择，检测仪器选择，数据处理；其中敏化红细胞抗原选择用百白破联合疫苗替代；具体步骤如下：⑴.敏化红细胞的制备A液，取健康人抗凝O型血3人份以上混合，用PBS缓冲液洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞；取适量积压红细胞悬浮于1.3mg/L鞣酸PBS缓冲液中，溶液的体积比为1:40，置于37℃水浴中轻摇30分钟后再用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液制备成体积百分数为2.5%的红细胞悬浮液；B液，用吸附无细胞百白破联合疫苗与体积百分数为1%氯化铬溶液0.25ml混合，溶液的体积比为10:1，混合后，置于37℃水浴中轻摇15分钟；将A液、B液按体积比1:4混合，置于37℃水浴中轻摇30分钟；离心，去上清液，用PBS缓冲液将沉淀的敏化红细胞洗涤3次，用牛白蛋白‑巴比妥缓冲液将悬浮红细胞溶液调节至适宜浓度即使其在波长541nm处的吸光度为1.0±0.1：⑵.参考品和供试品溶液的制备     用0.5mol/L氢氧化钠溶液将参考品和样品pH调节至6.8～7.0，根据溶液实际情况操作时，再用牛白蛋白‑巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每1ml含40mg蛋白含量；⑶.测定法用GE公司Ultrospec 6300pro紫外/可见光分光光度计或相同精度水平的紫外/可见光分光光度测定:取供试品溶液0.45ml，加入敏化红细胞悬液0.050ml，混匀，置于37℃水浴中轻摇30分钟；离心，去上清液，用牛白蛋白‑巴比妥缓冲液1ml洗涤红细胞，共洗3次；末次离心后弃上清液400μl，向沉淀中加入300μl预热到37℃的牛白蛋白‑巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每1ml含150 units的血清总补体活性CH50的豚鼠补体200μl，混匀后立即照紫外‑可见光分光光度法在波长541nm处测定起始吸光度As，启动SWIFT II 反应动力曲线测定软件swftrk.exe，每隔1分钟测定1次，既得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线；当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止测量；参考品及阴性对照的牛白蛋白‑巴比妥缓冲液可平行操作，根据GE公司Ultrospec 6300pro仪器检测通量，一次可实现处理8个样品；按公式（1）分别计算出参考品、供试品和阴性对照曲线斜率；按公式（2）计算供试品激活补体的功能指数IFc：S’=Sexp/As  (1)IFc=100%×[(Ss’‑Sc’)/ (Sr’‑Sc’ )]  (2)公式中：S’为用As修正Sexp得到的曲线斜率；   ………As分别为供试品、参考品及阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度；…………Sexp分别为根据供试品、参考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的曲线最大斜率；        IFc为供试品激活补体的功能指数；        Ss’为供试品曲线斜率；        Sc’为阴性对照曲线斜率；        Sr’为参考品曲线斜率。