构建基因工程菌增强1，3-丙二醇生产菌株抗逆性的方法

摘要

一种构建基因工程菌增强1，3-丙二醇生产菌株抗逆性的方法，属于生物化工技术领域。在产生PDO的野生菌中，引入β-酮基乙酰辅酶A硫解酶、NADPH依赖型乙酰乙酰辅酶A还原酶和聚羟基脂肪酸合酶基因，使菌株在生产PDO的同时，可积累高浓度PHB，显著提高菌体对甘油和3-羟基丙醛的耐受性；本发明还可用于PHB和PDO的联产。优点在于，所构建基因工程菌显著提高了菌体对高甘油浓度和中间产物3-羟基丙醛的抗逆性，降低了工业生产中的发酵异常现象的发生；另一方面，可在生产PDO的同时积累高浓度的PHB，PHB也可作为一种产物分离，提高了产品的附加值和原料利用率，降低了生产成本。

主权项

一种构建基因工程菌增强1，3‑丙二醇生产菌株抗逆性的方法，其特征在于，在产生PDO的野生菌中，引入β‑酮基乙酰辅酶A硫解酶、NADPH依赖型乙酰乙酰辅酶A还原酶和聚羟基脂肪酸合酶基因，使菌株在生产PDO的同时，积累高浓度PHB，提高菌体对甘油和3‑羟基丙醛的耐受性；或用于发酵联产PHB和PDO；所述的基因工程菌的构建步骤包括：(1)以携带有β‑酮基乙酰辅酶A硫解酶、NADPH依赖型乙酰乙酰辅酶A还原酶和聚羟基脂肪酸合酶基因的质粒pBHR68为模板，通过PCR聚合酶联反应的方法将其操纵子phbCAB完整克隆下来；(2)把PCR产物β‑酮基乙酰辅酶A硫解酶、NADPH依赖型乙酰乙酰辅酶A还原酶和聚羟基脂肪酸合酶基因片段纯化后与克隆载体连接；(3)筛选阳性克隆载体并分别用EcoRI和BamHI酶切，回收，连接表达载体，构建重组表达载体pDK‑CAB；(4)将构建好的重组表达载体pDK‑CAB转化到感受态大肠杆菌中，在卡那霉素抗性平板上筛选阳性克隆；(5)从阳性克隆里提取重组表达载体pDK‑CAB，并通过电转化或化学转化法将其转化到克雷伯氏菌感受态细胞里，鉴定并分离出阳性克隆，为目的菌株；所构建的基因工程菌用于提高菌体对甘油和3‑羟基丙醛的耐受性或发酵联产PDO和PHB；其工艺为：将所构建的基因工程菌在固体培养基上培养16～24h，接入种子培养基30～37℃有氧培养16～24h，以1％～5％的体积接种量接入以甘油为发酵底物的发酵培养基；发酵温度30～37℃，发酵过程中流加甘油使发酵液中甘油浓度控制在30～60g/L，pH值控制在5.0～8.0，40～60h后停止流加至发酵结束；发酵过程中向罐中通入0.4‑1.0vvm的空气，搅拌转速150‑250rpm；所述的用于构建基因工程菌的野生型菌株为克雷伯氏菌；所构建的基因工程菌发酵底物为甘油。