Métodos para la síntesis de polipéptidos hetero-multinuméricos en levaduras usando una estrategia de apareamiento haploide

摘要

Un método para la síntesis y recuperación de una proteína heteromultimérica heteróloga (no de levadura), biológicamente activa, secretada que comprende al menos dos cadenas de polipéptido de subunidades no idénticas, caracterizado por las siguientes etapas: (i) producir una o varias células de levadura de Pichia diploides estables mediante apareamiento o fusión de esferoplastos de células de Pichia haploides en condiciones tales que dichos eventos de apareamiento o fusión de esferoplastos dan como resultado la producción de una o varias células de Pichia diploides, donde dichas una o varias células de Pichia diploides después de dicho apareamiento o fusión comprenden constructos de expresión que proporcionan la expresión y secreción de al menos dos cadenas de polipéptido no idénticas que constituyen dicha proteína heteromultimérica, y cuyas células de Pichia diploides estables son susceptibles de ensamblaje y expresión y expresión y secreción prolongada de dicha proteína heteromultimérica en un medio de cultivo que contiene dichas una o varias células de Pichia diploides estables cuando dichas una o varias células de Pichia diploides se cultivan en condiciones de cultivo apropiadas; (ii) después de efectuar dicho apareamiento o fusión de esferoplastos, identificar y aislar las una o varias células de levadura de Pichia diploides resultantes que contienen constructos de expresión que proporcionan la expresión y secreción estables de al menos dos cadenas de polipéptido no idénticas que constituyen dicha proteína heteromultimérica cuando dichas una o varias células de Pichia diploides se cultivan en condiciones de cultivo apropiadas; (iii) hacer crecer dichas una o varias células de Pichia diploides aisladas o su progenie diploide en un medio de cultivo en condiciones que dan como resultado la expresión, ensamblaje y secreción de dicha proteína heteromultimérica biológicamente activa en el medio de cultivo; y (iv) recuperar la proteína heteromultimérica resultante del medio de cultivo.