一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法

摘要

本发明公开了一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法。本发明所述方法是利用ZEN-BSA、ZEN单克隆抗体和ZEN的β型抗独特型单抗建立的竞争ELISA方法，以ZEN的β型抗独特型单抗替代ZEN标准品，从而避免了毒素对操作者的危害及向环境中散毒的可能，实现无毒检测；该方法不需使用ZEN标准品，可大大降低成本，可以大规模地对食品、谷物和饲料等污染的玉米赤霉烯酮进行快速、灵敏的检测，因此将具有良好的市场前景。

主权项

一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法，所述方法是以ZEN‑BSA、ZEN单克隆抗体和ZEN的β型抗独特型单抗建立的竞争ELISA检测方法，其中，所述ZEN单克隆抗体为Ab1‑1G4，由杂交瘤细胞1G4G10D3分泌，杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201237；所述ZEN的β型抗独特型单抗为Ab2β‑1D5，由杂交瘤细胞株1D5分泌，杂交瘤细胞株1D5于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201238；具体检测方法包括如下步骤：    （A）预包被条的制备：（1）包被：用包被缓冲液即pH9.6的0.05M碳酸钠缓冲液将检测抗原ZEN‑BSA稀释至1 µg/mL，每孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，37℃孵育3h；（2）洗涤：倒出微孔板孔中包被缓冲液后，用洗瓶或多通道移液器将200μl 洗涤液加入孔中，3～5min后再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，洗涤3~5次；所述洗涤液为PBS‑T；（3）封闭：在微孔板每孔加入150～200μL含0.5%～3％BSA的0.01M PBS，37℃封闭0.5h～1.5h；（4）按步骤（2）洗涤微孔3～5次；（5）加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h；（6）干燥：微孔板干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存待用；（B）ZEN的检测：（7）每个板孔内分别加入50μl系列浓度的ZEN的β型抗独特型单抗标准液或处理好的样品提取液到微孔中，混匀；（8） 加入50µL 浓度为0.025µg/mL 的ZEN单抗到微孔，混合，37℃孵育1～2h；（9）洗涤微孔3～5次； （10）加入100 µL1:4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37 ℃孵育40 min；（11）洗涤微孔3～5次；（12）每个微孔加入100μL 显色液TMB底物工作液，反应10～20min；（13）每个微孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，并轻轻振荡混匀；（14）在15min内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD值；（15）计算出样品中实际的ZEN的浓度。