修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体

摘要

本发明提供了使用基于序列的分析和合理的策略来修饰且改善免疫结合剂，特别是单链抗体（scFv）的结构和生物物理学性质（包括性质如稳定性、溶解性和/或抗原结合亲和力）的方法。本发明提供了通过在经由分析所选择的稳定scFv序列的数据库鉴定的氨基酸位置处进行一个或多个置换而改造免疫结合剂，特别是scFv的方法，其中用于置换的优选氨基酸残基已得到鉴定。本发明还提供了根据本发明的改造方法制备的免疫结合剂。本发明还提供了CDR序列可以插入其内的优选的scFv构架支架，以及使用这些优选的构架支架制备的scFv抗体。

主权项

改造免疫结合剂的方法，所述免疫结合剂包含（i）重链可变区或其片段，所述重链可变区包含VH构架残基，和/或（ii）轻链可变区或其片段，所述轻链可变区包含VL构架残基，所述方法包括：A）选择在所述VH构架残基、VL构架残基或VH和VL构架残基内的一个或多个氨基酸位置用于突变；和B）使选择用于突变的所述一个或多个氨基酸位置突变，a）其中如果选择用于突变的所述一个或多个氨基酸位置在重链可变区，那么所述突变包括选自下述的一个或多个置换：（a）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置1处的谷氨酸（E）或谷氨酰胺（Q）；（b）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置6处的谷氨酸（E）或谷氨酰胺（Q）；（c）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置7处的苏氨酸（T）、丝氨酸（S）或丙氨酸（A）；（d）使用AHo编号系统的氨基酸位置10（使用Kabat编号系统的氨基酸位置9）处的丙氨酸（A）、苏氨酸（T）、脯氨酸（P）、缬氨酸（V）或天冬氨酸（D）；（e）使用AHo编号系统的氨基酸位置12（使用Kabat编号系统的氨基酸位置11）处的亮氨酸（L）或缬氨酸（V）；（f）使用AHo编号系统的氨基酸位置13（使用Kabat编号系统的氨基酸位置12）处的缬氨酸（V）、精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）、甲硫氨酸（M）或赖氨酸（K）；（g）使用AHo编号系统的氨基酸位置14（使用Kabat编号系统的氨基酸位置13）处的精氨酸（R）、甲硫氨酸（M）、谷氨酸（E）、谷氨酰胺（Q）或赖氨酸（K）；（h）使用AHo编号系统的氨基酸位置19（使用Kabat编号系统的氨基酸位置18）处的亮氨酸（L）或缬氨酸（V）；（i）使用AHo编号系统的氨基酸位置20（使用Kabat编号系统的氨基酸位置19）处的精氨酸（R）、苏氨酸（T）、赖氨酸（K）或天冬酰胺（N）；（j）使用AHo编号系统的氨基酸位置21（使用Kabat编号系统的氨基酸位置20）处的异亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）、亮氨酸（L）或缬氨酸（V）；（k）使用AHo编号系统的氨基酸位置45（使用Kabat编号系统的氨基酸位置38）处的精氨酸（R）或赖氨酸（K）；（l）使用AHo编号系统的氨基酸位置47（使用Kabat编号系统的氨基酸位置40）处的苏氨酸（T）、脯氨酸（P）、缬氨酸（V）、丙氨酸（A）或精氨酸（R）；（m）使用AHo编号系统的氨基酸位置50（使用Kabat编号系统的氨基酸位置43）处的赖氨酸（K）、谷氨酰胺（Q）、组氨酸（H）或谷氨酸（E）；（n）使用AHo编号的氨基酸位置55（使用Kabat编号的氨基酸位置48）处的甲硫氨酸（M）或异亮氨酸（I）；（o）使用AHo编号的氨基酸位置77（使用Kabat编号的氨基酸位置66）处的赖氨酸（K）或精氨酸（R）；（p）使用AHo编号系统的氨基酸位置78（使用Kabat编号系统的氨基酸位置67）处的丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）；（q）使用AHo编号系统的氨基酸位置82（使用Kabat编号系统的氨基酸位置71）处的谷氨酸（E）、精氨酸（R）、苏氨酸（T）或丙氨酸（A）；（r）使用AHo编号系统的氨基酸位置86（使用Kabat编号系统的氨基酸位置75）处的苏氨酸（T）、丝氨酸（S）、异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）；（s）使用AHo编号系统的氨基酸位置87（使用Kabat编号系统的氨基酸位置76）处的天冬氨酸（D）、丝氨酸（S）、天冬酰胺（N） 或甘氨酸（G）；（t）使用AHo编号系统的氨基酸位置89（使用Kabat编号系统的氨基酸位置78）处的丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或苯丙氨酸（F）；（u）使用AHo编号系统的氨基酸位置90（使用Kabat编号系统的氨基酸位置79）处的苯丙氨酸（F）、丝氨酸（S）、组氨酸（H）、天冬氨酸（D）或酪氨酸（Y）；（v）使用AHo编号系统的氨基酸位置92（使用Kabat编号系统的氨基酸位置81）处的天冬氨酸（D）、谷氨酰胺（Q）或谷氨酸（E）；（w）使用AHo编号系统的氨基酸位置95（使用Kabat编号系统的氨基酸位置82b）处的甘氨酸（G）、天冬酰胺（N）、苏氨酸（T）或丝氨酸（S）；（x）使用AHo编号的氨基酸位置98（使用Kabat编号的氨基酸位置84）处的苏氨酸（T）、丙氨酸（A）、脯氨酸（P）、苯丙氨酸（F）或丝氨酸（S）；（y）使用AHo编号系统的氨基酸位置103（使用Kabat编号的氨基酸位置89）处的精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、甲硫氨酸（M）或苯丙氨酸（F）；和（z）使用AHo编号系统的氨基酸位置107（使用Kabat编号系统的氨基酸位置93）处的天冬酰胺（N）、丝氨酸（S）或丙氨酸（A）；和b）其中如果选择用于突变的所述一个或多个氨基酸位置在轻链可变区，那么所述突变包括选自下述的一个或多个置换：（aa）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置1处的亮氨酸（L）、谷氨酰胺（Q）、丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）或异亮氨酸（I）；（bb）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置2处的丝氨酸（S）、丙氨酸（A）、脯氨酸（P）、酪氨酸（Y）、异亮氨酸（I） 或苏氨酸（T）；（cc）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置3处的谷氨酰胺（Q）、缬氨酸（V）、苏氨酸（T）或异亮氨酸（I）；（dd）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置4处的缬氨酸（V）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）或甲硫氨酸（M）；（ee）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置7处的丝氨酸（S）、谷氨酸（E）、脯氨酸（P）；（ff）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置10处的苏氨酸（T）或异亮氨酸（I）；（gg）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置11处的丙氨酸（A）或缬氨酸（V）；（hh）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置12处的丝氨酸（S）或酪氨酸（Y）；（ii）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置14处的苏氨酸（T）、丝氨酸（S）或丙氨酸（A）；（jj）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置18处的丝氨酸（S）或精氨酸（R）；（kk）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置20处的苏氨酸（T）或丙氨酸（A）；（ll）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置24处的精氨酸（R）或谷氨酰胺（Q）；（mm）使用AHo编号系统的氨基酸位置46（使用Kabat编号系统的氨基酸位置38）处的组氨酸（H）或谷氨酰胺（Q）；（nn）使用AHo编号系统的氨基酸位置47（使用Kabat编号系统的氨基酸位置39）处的赖氨酸（K）、精氨酸（R）或异亮氨酸（I）；（oo）使用AHo编号系统的氨基酸位置50（使用Kabat编号系统的氨基酸位置42）处的赖氨酸（K）、精氨酸（R）、谷氨酸（E）、苏氨酸（T）、甲硫氨酸（M）或谷氨酰胺（Q）；（pp）使用AHo编号系统的氨基酸位置53（使用Kabat编号系 统的氨基酸位置45）处的赖氨酸（K）、苏氨酸（T）、丝氨酸（S）、天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）或脯氨酸（P）；（qq）使用AHo编号系统的氨基酸位置56（使用Kabat编号系统的氨基酸位置48）处的异亮氨酸（I）或甲硫氨酸（M）；（rr）使用AHo编号系统的氨基酸位置57（使用Kabat编号系统的氨基酸位置49）处的组氨酸（H）、丝氨酸（S）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；（ss）使用AHo编号系统的氨基酸位置74（使用Kabat编号系统的氨基酸位置58）处的异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）或苏氨酸（T）；（tt）使用AHo编号系统的氨基酸位置82（使用Kabat编号系统的氨基酸位置66）处的精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）或赖氨酸（K）；（uu）使用AHo编号系统的氨基酸位置91（使用Kabat编号系统的氨基酸位置73）处的亮氨酸（L）或苯丙氨酸（F）；和（vv）使用AHo编号系统的氨基酸位置92（使用Kabat编号系统的氨基酸位置74）处的甘氨酸（G）、苏氨酸（T）、天冬氨酸（D）、丙氨酸（A）；（xx）使用AHo编号系统的氨基酸位置94（使用Kabat编号系统的氨基酸位置76）处的丝氨酸（S）或天冬酰胺（N）；（yy）使用AHo编号系统的氨基酸位置101（使用Kabat编号系统的氨基酸位置83）处的缬氨酸（V）、酪氨酸（Y）或丝氨酸（S）；和（zz）使用AHo编号系统的氨基酸位置103（使用Kabat编号系统的氨基酸位置85）处的天冬氨酸（D）、组氨酸（H）、谷氨酸（E）、苯丙氨酸（F）、亮氨酸（L）、丙氨酸（A）、苏氨酸（T）、缬氨酸（V）、丝氨酸（S）、甘氨酸（G）或异亮氨酸（I）。