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一种藏羚羊‑山羊种间克隆胚胎构建与体外培养的方法，包括以下步骤：(1)卵巢的采集：将刚屠宰的山羊的卵巢剪取后，放入装有生理盐水、温度为20～25℃的保温瓶中，然后将山羊卵巢放在盛有拣卵液的培养皿中，采用切剖法拣取卵泡液中卵丘‑卵母细胞复合体；拣卵液是由占总溶液体积的3％的新生牛血清和97％的杜氏磷酸缓冲液组成；(2)卵母细胞的体外成熟培养：将所述步骤(1)所得的卵丘‑卵母细胞复合体用成熟液清洗后，在饱和湿度二氧化碳培养箱中成熟培养20～24h，得到成熟卵母细胞；成熟液是由占总溶液体积的10％的胎牛血清和90％的含0.22g/100mL NaHCO3的TCM199基础培养液及0.22mg/100mL的丙酮酸钠、238mg/100mL的羟乙基哌嗪乙磺酸、75μg/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素、10μg/mL的卵泡刺激素、10μg/mL的促黄体生成激素、1μg/mL的17β雌二醇组成；(3)成熟卵母细胞的手导式去核：将所述步骤(2)所得的成熟卵母细胞经卵丘颗粒细胞去除、卵母细胞化学显核、透明带的消化、卵母细胞去核后，得到去核受体卵母细胞；其中：卵丘颗粒细胞去除是指将成熟卵母细胞移至装有0.5mL透明质酸酶的离心管中，用移液枪轻轻吹打2min，吹打完毕后再漩涡震荡2min；此时培养皿中卵母细胞透明带外围的卵丘颗粒细胞已经移除；卵母细胞化学显核是指将卵母细胞置于400μL含有20μL脱羰秋水仙碱的卵母细胞成熟液内，然后在饱和湿度二氧化碳培养箱内培养2h；培养完毕后将卵母细胞从培养液中取出，用T20清洗干净，备用；透明带的消化是指将卵母细胞放置T20微滴内，再移至50μL链酶蛋白酶微滴内，消化透明带3～5min，待透明带全部消化以后，将无透明带卵母细胞放置在T20微滴内，稳定15min；卵母细胞去核是指在T20中添加浓度为5μg/mL的细胞松弛素，然后在35mm培养皿内加入2mL T20溶液充当切卵液；将无透明带的卵母细胞转移至培养皿内，排成一列，然后以第一极体和无透明带卵母细胞表面凸起为标识，用去核刀将第一极体和表面凸起切掉；切掉部分为整个卵母细胞的1/3 大小，另外一部分无核的卵母细胞质转移至T20中，恢复15min，待其完全复圆后进行细胞融合；T20是由占总溶液体积的20％的胎牛血清和80％的含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7.2～7.4的溶液；其中双抗是指75μg/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素；(4)供体细胞准备与细胞融合：将培养在24孔板中的供体细胞与所述步骤(3)所得的去核受体卵母细胞采用化学辅助融合法进行细胞融合，得到种间克隆胚胎；供体细胞——藏羚羊耳部组织的成纤维细胞采用如下方法获得：①藏羚羊耳部皮肤组织原代培养：将藏羚羊耳部皮肤组织用含有双抗的D‑PBS浸洗5次，每次浸泡3min；再用含有双抗的DMEM/F12培养液冲洗3遍后，将样本组织块放入35mm培养皿中，用剪刀尽量将组织块剪碎；然后用吸管将碎组织块移入预先用胎牛血清涂布的培养瓶中，均匀地摆放于培养瓶底部；最后将培养瓶慢慢翻转，倒置放在饱和湿度二氧化碳培养箱中，3h后轻轻翻转培养瓶，加入3～5mL DMEM/F12培养液继续培养10～18天，得到生长至80％～90％汇合的原代细胞；DMEM/F12培养液均是由占总培养液体积的10％的胎牛血清、90％的DMEM/F12和双抗组成；②传代与纯化：将原代细胞进行传代培养；首先将原代细胞用无Ca2+、Mg2+的PBS清洗2次，再用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，得到消化液A；将消化液A放入饱和湿度二氧化碳培养箱2～3min，取出，在显微镜下观察消化情况，轻轻敲打底部，然后加入与消化液A等量的DMEM/F12培养液终止消化，得到消化液B；将消化液B转移至离心管中以1000转/分钟离心5min，去上清液后，得到细胞沉淀物A；用DMEM/F12培养液将细胞沉淀物A轻轻混匀，传入另一个培养瓶中，在饱和湿度二氧化碳培养箱中继续培养3～6天，得到生长至80％～90％汇合的皮肤成纤维细胞，该皮肤成纤维细胞呈梭型；③细胞冻存：将皮肤成纤维细胞用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，离心后加入细胞冻存液混匀，先在4℃保存半小时，然后将细胞冻存盒直接放入‑70℃冰箱中过夜，最后直接投入液氮保存，得到冻存皮肤成纤维细胞；④细胞复苏：将装有冻存皮肤成纤维细胞的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中融化，吸出细胞悬液放于15mL离心管中，用9倍所述细胞悬液体积的DMEM/F12培养液进行洗涤后，以1000转/分钟离心5min，去上清后，得到细胞沉淀物B；用DMEM/F12培养液充分悬浮细胞沉淀物B，并接种于培养瓶中，置于饱和湿度二氧化碳培养箱中培养即可；化学辅助融合法是指：首先，将供体细胞培养在24孔板中；核移植时选择培养孔内底部全部长满的细胞作为供体细胞。每次消化1孔细胞，然后将少量细胞移入到T2B的微滴中；T2B是指在TCM199基础培养液中加入总溶液体积的2％的胎牛血清和8mg/mL牛血清白蛋白所得的溶液；其次，在60mm培养皿内按常规方法制作体积为25μL的融合微滴；然后依次将受体卵母细胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴内进行操作，微滴上覆石蜡油，避免微滴蒸发和位置移动；先将受体卵母细胞移至T20微滴内，再移一个受体卵母细胞至植物血凝素微滴内，然后转移到T2B微滴中粘取一个供体细胞，再重新转移至植物血凝素微滴中，再从T20微滴中移一个受体卵母细胞至植物血凝素微滴中，由于植物血凝素可使细胞表面具有粘性，所以通过调整供体细胞与受体卵母细胞复合体和另一卵母细胞的位置，可形成两个卵母细胞夹杂一个供体细胞的复合体；将复合体移至融合液内平衡2～3min后，再至融合槽内以交流电场7V，脉冲电场70V，持续时间20μs，持续两次，每次间隔0.1s进行电融合即可；(5)种间克隆胚胎激活与体外培养：将所述步骤(4)所得的种间克隆胚胎在T20微滴中平衡20～30min，待一个供体细胞和两个去核受体卵母细胞全部融合后，在胚胎培养液中平衡3h；然后将所述种间克隆胚胎置于1mL含钙离子载体的溶液中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内培养5min；再将所述种间克隆胚胎转移至微滴体积为10μL的6‑二甲基氨基嘌呤中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内培养4.5h后完成藏羚羊‑山羊种间克隆胚胎的激活；将藏羚羊‑山羊种间克隆胚胎激活后放入装有0.5mL胚胎培养液的4孔板底部的微穴中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内进行培养即可；胚胎培养液是由0.6294g/100mL的NaCl、0.0534g/100mL的KCl、0.0162g/100mL的KH2PO4、0.0251g/100mL的CaCl2·2H2O、47μL/100mL的乳酸钠、0.01g/100mL的MgCl2·6H2O、 0.2106g/100mL的NaHCO3、0.0033g/100mL的丙酮酸钠、0.0146g/100mL的L‑谷氨酰胺、2mL/100mL的必需氨基酸、1mL/100mL的非必需氨基酸、0.8g/100mL的牛血清白蛋白、0.005g/100mL的庆大霉素和0.001g/100mL的酚红组成；T20是由占总溶液体积的20％的胎牛血清和80％的含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7.2～7.4的溶液；其中双抗是指75μg/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。 |
